Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

      Қайта дамитын жасуша дақылдарын белгілі бір жағдайларда шектеусіз in vitro көбею қабілетіне ие қатерлі жасушалар қатарынан дайындайды. Оларға, мысалы, алғашқы рет жатыр мойынының карциномасынан бөліп алынған қатерлі HeLa жасушалары, лимфоидты карциномадан алынған Hep-3 және т.б. жатады.

      Жасушалық дақылдарды  өсіріп-өндіру үшін құрамында  энергия көзі, минеральді заттар, аминоқышқылдар, витаминдер және басқа өсу факторлары бар күрделі құрылымды қоректік орталар қолданылады. Жасушалар орта рН-ның өзгеруіне өте сезімтал.  Ортаның рН-н бақылап тұру үшін индикатор қосады. Жасушалық дақылдардың көбісі дақылдауға арналған контейнер (шыны түтікше, пластикалы планшет немесе төртқырлы құты) беткейіне берік бекіне отырып жалаң қабат түрінде өседі. Кейбір жасуша типтері суспензияларда өсуге де қабілетті.

      Жасушалардың біріншілік дақылдарын дайындау бірнеше кезектік кезеңдерден тұрады: ұлпаны майдалау, трипсинизация жолымен жасушаларды даралау, оқшауланған жасушалардың алынған біртекті суспензиясын трипсиннен шайып олардың өсуін қамтамасыз ететін қоректік орталаға себу (мысалы,  бұзаудың қан сарысуы қосылған № 199 ортаға). Тұну барысында жасушалар шыны ыдыстың ішкі беткейіне берік бекіне отырып, жалаң қабат түрінде орналасады. Өмір сүруге бейім жасушалар дақылы алынған соң оларды риккетсиясы, хламидиясы немесе вирусы бар материалдармен залалдайды. Аталған микробтар сол жасушалар ішіне еніп, сонда көбейеді.

    Жасуша ішілік паразиттер өздерінің репродукциясы жүретін жасушаларға цитопатиялық әсер (ЦПӘ) береді. ЦПӘ залалданған жасушалардың деструкциясы (лизисі), олардың морфологиясының өзгеруі (жасушаның немесе оның ядросының өлшемдері мен пішіндерінің өзгеруі, вирустардың синцитсия түзе отырып жасуша ішілік шоғырлануы ретінде берілетін вакуольдар мен ендірмелердің пайда болуы) және функцияларының бұзылуы ретінде айқындалады.

     Т а у ы қ   э м б р и о н д а  р ы. Тауық эмбриондары жасуша  дақылдарымен салыстырғанда вирустармен және микоплазмалармен едәуір сирек контаминацияланады, сонымен қатар, әртүрлі әсерлерге қарсы жоғары тұрақтылық пен өміршеңділік қасиеттеріне ие. Олар адамға патогенді хламидияларды, риккетсияларды және қайсы-бір вирустарды дақылдауға да жарамды.

Диагностикалық мақсатта риккетсиялар мен хламидиялардың және бірқатар вирустардың таза дақылдарын алу үшін және де әртүрлі препараттарды (вакциналар, диагностикумдер) дайындау үшін 8-12 күндік тауық эмбрионын қолданады. Бұл әдістің кемшілігіне эмбрионды жармайынша зерттелетін микроорганизмді табу мүмкін еместігі, және де ақуыздар мен басқа да қосылыстар мөлшерінің көп болуы салдарынан әртүрлі препараттарды дайындау кезінде қоздырғышты тазалап алу қиындығы жатады.

     Тауық эмбриондарын  залалдау үшін зерттелетін материалды олардың амнионды және аллантоисты қуыстарына, хорион-аллантоисты қабықшасына немесе сарыуыз қапшығына ендіреді. (сурет 5.2.1).

     Аллантоисты қуысқа  залалдау үшін қайшыменен, скальпельменен  немесе арнайы бұрғыменен ақ  қабықтың кеуекті камерасы үстінен кішкене саңлау жасаймыз (жұмыртқаны жарыққа қарсы ұстап тұрып оның шекарасын қаламмен сызып аламыз). Кеуекті камера шегінен 2-3 мм төменгі тереңдікке 0,1-0,2 мл вирусы бар материалды шприцпен ендіреміз. Ақ қабықтағы саңлауды еріген парафинмен тығындаймыз. Залалданған эмбриондарды жару вирустардың максимальді жинақталу мерзімінде жүргізіледі (37°С та инкубациялаудың 48-72 сағаттарынан соң). Спиртпен немесе 2% йод ерітіндісімен өңдеген соң қайшыменен кеуекті камераның шекарасын қалам сызығы ізінен сәл жоғары ала, ақ қабықты кесеміз. Кесіп жатқанда ақ қабық кеуекке түсіп кетпеу үшін жұмыртқаны аздап еңкейтіп ұстаймыз. Кесілген ақ қабықты сыртқа тастаймыз да,  абайлап, оның астындағы қабықшаны ашып, хорион-аллантоисты қабықшадағы залалдау орны айналасын қараймыз. Егер вирус репродукциясы жүріп жатса, зақымдалу ошағы – геморрагиялар, теңбілдер т.б. байқалады. Сонан соң, хорион-аллантоисты қабықшаның қан тамырларынан бос бөлігін Пастер тамызғышымен тесіп өтіп, аллантоисты сұйықтықты сорып аламыз. Соңында хорион-аллантоисты қабықшаны алып, натрий хлоридінің ерітіндісімен екі мәрте шайып, Петри табақшасына саламыз да қара фонда спецификалық зақымдалуларды байқайды.

      З е р т х  а н а л ы қ   ж а  н у а р л а р.  Жануарлардың  түрлік сезімталдылығы, олардың жасы вирустардың репродуктивті қабілетіне ықпал етеді. Көптеген жағдайларда тек жаңа туылған жануарлар қандайда бір болмасын вирусқа сезімтал (мысалы, тышқан балалары Коксаки вирустарына). Облигатты жасуша ішілік паразиттерді зертхана жануарлары ағзасында дақылдау әдісінің басқалардан артықшылығы – жасуша дақылдары мен тауық эмбрионында нашар репродукцияланатын вирустарды бөліп алуға мүмкіншіліктің болуында. Жетіспеушілігі – тәжірибедегі жануарлардың бөгде вирустармен және микоплазмалармен контаминациялану мүмкіндігінің жоғары болуында, және де жасуша дақылдарын сол вирустың таза дақылын алу үшін тағы да залалдау қажеттілігінде. Бұл зерттеу мерзімін ұзарта түседі.

Сурет 5.2.1. Тауық эмбрионын залалдау әдістері.

1. амнионды қуысқа;  2. аллантоисты қуысқа;  3. сарыуыз қапшығына.

      В и р у с  т а р д ы   и н д  и к а ц и я л а у   ә д і с т е р і. Жасуша  дақылында вирустардың бар екендігін  демонстриациялау үшін бірнеше  әдістер қолданады.

     І. Вирустардың жасуша  дақылында көбеюі (репродукциясы) олардың цитопатиялық әсері (ЦПӘ) арқылы байқалады, яғни вирустардың әсерінен пайда болған жасушалардағы морфологиялық өзгерістер микроскоп көмегімен анықталады. Мұндай жасушалардың бір бөлігі өліп, шыны қабырғасынан ысылып түседі.  Бір жасушалардың жойылуы кезінде босап шыққан вирустық бөлшектер басқа жасушаларды залалдап, оларды да өлтіріп, әрі қарай ауысып отырады. Нәтижесінде біртекті жасушалық жалаң қабаттан бірең-сараң жасушалық аралшықтар қалады. Әртүрлі вирустардан туындаған ЦПӘ сипаты бірдей болмайды. Бір вирустардың репродукциясында (парамиксовирустар, герпесвирустар) жасушалардың синцитсия түзе отырып бірігулері байқалса, енді біреулерінде (энтеровирустар, реовирустар) жасушалардың әжімденуі мен деструкциясы, үшіншілерінде (аденовирустарда) жасушалардың агрегациясы жүреді. (сурет 5.2.2.). Вирустардың ЦПӘ-ін жасуша дақылдарын вирусы бар материалмен залалдап болған соң  микроскоп арқылы әртүрлі мерзімде бақылай отырып, динамикасымен бағалайды. Кейбір вирустар (энтеровирустар, герпесвирустар) ЦПӘ-ін 1-2 тәулік ішінде, басқа біреулері 4-6 тәуліктен соң тудырады. ЦПӘ сипатын вирустарды индикациялау мақсатында да шамалап идентификациялау мақсатында да, яғни олардың түрлік тегін анықтауда қолданады.

     Кейбір вирустарды  залалдаған жасуша ядросында немесе цитоплазмасында түзген ендірмелері бойынша табуға және идентификациялауға болады. Ендірмелердің пішіндері әртүрлі болады, өлшемдері 0,25-тен 25 мкм аралығында байқалады. Олар вирустық бөлшектердің жиылыстары түрінде байқалады. Және де зақымдалған тіннен дайындалып, Романовский-Гимзе әдісімен боялған немесе флюрохроммен өңделген препараттардан анықталады. Флюрохроммен өңделген препараттарды люминесцентті микроскоппен зерттейді. 

      Риккетсиялармен  зақымдалған жасушаларда 3-8 ші күндері  цитоплазма мен  ядроны түгелдей толтырып тұрған, артынша түгел қырылып қалатын көп мөлшердегі коккобациллярлы формалар байқалады. Хламидиялар Романовский-Гимзе әдісімен боялған препараттарда қарастырылады. Олар жасушаларда микроколониялар  ретінде берілген цитоплазмалық ендірмелер түзеді.

       Контаминацияланған  жасушалардың морфологиясын зерттеу  үшін жарықтандырғыш үстінде, ал  объективі бұйым үстелшесі астында  орналасқан арнайы инвертацияланған  микроскоп қолданады. Осындай құралдың  көмегімен дақылдауға арналған контейнерлар беткейіндегі жалаң қабат ретінде өсіп жатқан жасушалардың морфологиясын бағалауға болады. Жасушалардың морфологиялық өзгерісін 8х немесе 40х объективтерінің көмегімен микроскопиялық зерттеу кезінде айқындайды. Бақылау сынамасында вируспен залалданған жасушалар моноқабатын, залалданбаған жасушалармен салыстырғанда жасушалар жайылмасының толық немесе ақтаңдақтанып бұзылғанын, не болмаса вирустың ЦПӘ-сын сипаттайтын басқа да өзгерістерін байқауға болады. ЦПӘ-ін егжей-тегжейлі пайымдау үшін дақылдауға арналған контейнерге  моноқабаты бар жабынды шыныны орналастырады. Сонан соң, шыныны алып, залалданған жасушаларды бекіндіріп, микроскопиялық препарат дайындайды да, оны бояп (Романовский-Гимзе, флюрохром және т.б. әдістерімен), иммерсиялық әдіспен зерттейді.

Вирустардың ЦПӘ-ін "түрлі-түсті сынама" көмегімен де көрсетілім жасауға болады: өмір сүру барысында дақылдың метоболиттік белсенді жасушалары қышқыл өнімдер бөліп шығарады да дақылдық ортадағы индикатор түсінің өзгеруін туғызады. Вирустың репродукциясы кезінде жасушалар метаболизмге қабілеттілігін жоғалтады да өледі, сондықтан уақыт өтуімен бірге орта түсі өзгермейді.

ІІ. Гемадсорбция реакциясын гемагглютининацияланатын вирустарды индикациялау үшін қолданады. Бұл реакция осындай қасиеттері бар вирустар орныққан жасуша беткейлеріне эритроциттердің адсорбциялану қабілетіне негізделген. Гемадсорбция реакциясын жасау үшін вируспен залалданған жасушалар дақылына эритроциттер қоспасын ендіріп бірнеше жанаспа уақытынан соң жасушаларды нартрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісімен шаямыз. Вируспен залалданған жасуша беткейлерінде жабысқан күйде эритроциттер қалып қояды.

          ІІІ.  Гемагглютинация реакциясын (ГАР) залалданған жасушалар дақылының дақылдық сұйықтығындағы, не болмаса тауық эмбрионының хорионаллантоистық немесе амниондық сұйықтығындағы гемагглютинациялаушы вирустарды табу үшін қолданады. Жануарлардың сан-алуан түрлері (тауықтар, қаздар, теңіз шошқалары) эритроциттерінің гемагглютинациясын - "бір-біріне жабысуын" қабықшасында гемагглютинині бар вирустар туғызады. Гемагглютинация реакциясын жасау үшін зерттелетін материалға эритроциттер қоспасын қосады. Эритроциттер агглютинациясы  жүріп жатса, вирустың бар болғандығы.

Сурет 5.2.2. Жасушалар дақылы.

а- өзгермеген жасушалар;  б- жасушалардағы цитопатиялық өзгерістер

Тауық эмбрионын кесіп жарған соң аллантоисты сұйықтықты сорып алып, 0,5 мл-ден шыны түтікшелерге немесе плексигластты пластина оймақтарына құямыз (бақылау үшін 0,5 мл залалданбаған эмбрионның осындай сұйықтығын  алады). Сонан соң, 0,2 мл-ден тауықтың шайылған эритроциттерінің 1%-ті суспензиясын қосамыз да бөлме температурасында біраз ұстаймыз. Реакция нәтижелерін 40 минуттан кейін эритроциттер тұнып болған соң анықтаймыз: егер, түтікше түбінде қол шатыр түрінде бір-бірімен жабысқан эритроциттердің жұқа қабықшасы пайда болса  –  айқын гемагглютинация деп есептейміз де  (++ ++)-пен белгілейміз, қабықша саңлаулы болса – (+++), жабысқан эритроциттердің шашақталған жиегі бар қабықша түзілсе – (++), агглютинацияланған эритроциттердің түйіршіктері аймағымен қоршалған эритроциттердің үлпілдеген тұнбасы түзілген болса – (+) белгісін қоямыз. Бақылау түтікшесінен айырмашылығы жоқ, әрі эритроциттердің айқын шектелген тұнбасы байқалса гемагглютинация реакциясы болған жоқ деп есептеп, (–) белгісін қоямыз. Тәжірибедегі шыны түтікшелерде гемагглютинацияның болуы мен бақылау түтікшелерде болмауы зерттелетін сұйықтықта вирустың бар екендігін меңзейді. ГАР титрін анықтау үшін вирусы бар сұйықтықтың 10-1,10-2,10-3 және т.б. сұйылтпаларымен реакция жүргізеді. ГАР титрі ретінде гемагглютинация (++) байқалатын максимальді сұйылтпа қолданады. ГАР титрі вирустың белсенділігін сипаттайды және де ГАТР-ын  қоюда қолданады (10.2. тақырыбын қара).

Вирустық денешіктерді мөлшерлік табуы үшін титрлеу әдістері қолданады. Вирустардың титрін дақылдың ортаның 10 еселік сұйылтпаларымен немесе тауық эмбрионынан алынған материалдармен гемагглютинация реакцияларында, немесе жасуша дақылдарындағы ЦПӘ бойынша анықтауға болады. Оларды 6-7 күндік инкубациядан соң ЦПӘ бар-жоқтығына тексереді. Вирустың титрі ретінде залалданған дақылдың  50%-іне ЦПӘ берген ең үлкен сұйылтпасын қабылдайды. Вирус титрін цитопатиялық (инфекциялық) доза мөлшерімен (ИД50) атайды.

       Жекеленген вирустық  денешіктерді есептеудің ең нақты  мөлшерлік әдісі – қабыршақ әдісі (5.2.3 сурет). Жасуша дақылын вируспен залалдап олардың жұқа қабатымен жабады. Бірнеше тәулік бойы себінділерді инкубациялаған соң агар беткейінде белігі-бір пішіндегі саңлаулы бөлімшелер (теңбілдер) пайда болады.  

        Бұлар жасуша дақылдарының тұтастай моноқабатында өлген жасушалар орны. Әрбір теңбіл бір вирустық денешіктің өсуі барысында түзіледі. Оны тірідей бейтарап қызылымен боялған қызыл жасушалар аясында пайда болған дөңгелек жарқын бөлімшелер арқылы байқауға болады. Осы әдіспен белгіленген вирустың титрін 1 мл-дегі теңбіл түзуші бірліктер (ТТБ) санымен атайды. Теңбілдердің өлшемдерін, морфологиясын және пайда болу мерзімін әртүрлі вирустардың түрлерінде ғана емес, сол түрдің жекеленген штаммдарында да ажыратуға болады. Аталған белгілерді штаммдардың селекциясы үшін және вирустардың таза ұрпағын алу үшін де қолданады.

5.2.3. сурет.  Жасуша дақылындағы  вирустар колониялары (теңбілдері)                                                           

                          а- ньюкаскл ауруы вирусының теңбілі;  б- Коксаки вирусының теңбілі .   

Тақырып 5.3. БАКТЕРИЯЛЫҚ ВИРУСТАРДЫ (ФАГТАРДЫ)

                         ДАҚЫЛДАУ ӘДІСТЕРІ МЕН ОЛАРДЫҢ ИНДИКАЦИЯСЫ

Кіріспе. Бактериялардың вирусы немесе бактериофагтар (фагтар), қоршаған ортада – су қоймаларында, топырақта кеңінен тараған. Ішек бактерияларының (ішек таяқшасының, шигеллалардың, сальмонеллалардың) фагтарын тоған сулар мен нәжістерден бөліп алуға болады. Стафилококктардың фагтары мұрын-жұтқыншақ кілегейінен, тері мен жарақат бөліндісінен, анаэробты жарақат инфекциясын тудырушы клостридия фагтары жарақат бөліндісінен, топырақтан табылып жатады. Бір ортада фагтың кездесуі сол жерде оған сезімтал бактерияның болуының айғағы.

Фагтар вирулентті және әлсіздеу болып бөлінеді. Вирулентті фагтар жаңа фагтық денешіктердің түзілуі мен бактериялық жасушалардың лизисімен аяқталатын өнімді инфекция тудырады.