Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

Әлсіздеу фагтар өздері залалдаған жасушаларды лизиске ұшыратпайтын интегративті инфекция туғызады. Бұл фагтардың ДНҚ-сы бактерия хромосомасына тіркесіп, бактерия бөлінген сайын оның ұрпақтан ұрпағына тарайды. Фагтың жасушамен қарым-қатынасының мұндай типі лизогения, ал өз хромосомасында фагтық ДНҚ (профаг) бар бактерия лизогенді деп аталады. Лизогенді бактериялардың жасушасында әртүрлі факторлардың әсерінен профагтың индукциясының – оның ДНҚ-ның бактерия хромосомасынан үзіліп, өнімді инфекцияның дамуының жүріп кетуі мүмкін. Лизогенді фагтар табиғатта кеңінен тараған.

Бактериялардың сұйық ортада өсіп жатқан дақылының жасушаларындағы вирулентті фагтардың репродукциясы бактериялардың лизисін туындатады да ортаның саңлаулануына алып келеді. Фагтар Петри табақшасындағы тығыз қоректік ортада өсірілген сезімтал бактериялардың газонында  концентрацияларына байланысты ошақтық немесе тұтастай лизис аймақтарын тудырады. Ошақтық лизис аймақтары фагтардың негативті колониялары, немесе стерильді дақтар – теңбілдер деген атқа ие болды (5.3.1. сурет). Олардың морфологиясы жекеленген фагтарға тән болып келеді және де бір фагтық денешіктің бактериялық жасушаға еніп әрі қарай сонда репродукциялануынан туындайды. Фагпен инфекцияланған әрбір бактерия лизистенеді де жүздеген жаңа фагтық денешіктерден тұратын сол фагтың ұрпағын босатып шығарады.  Олар көрші жатқан жасушаға енеді де осы циклді қайталай береді. Жасушалардың лизисі нәтижесінде тұтастай бактериялық газонда фагтардың негативті колониялары пайда болады.

       

 

 Сурет 5.3.1.. Бактериофагтардың негативті колониялары (стерильді дақтары).

                           а – Т2 фагының дақтары;  б – Т1 фагының дақтары.

            Фагтардың "таза" ұрпағын алу  үшін (басқа фагтардың қоспасы  жоқ) морфологиялық тұрғыда біртекті  негативті фагтық колонияларды  сол бір бактериялық штаммның газонында бірнеше рет қайта егу жүргізеді.

Көптеген фагтар бактерияға қатысты түрспецификалық қасиет көрсетеді. Бірақ, сол бактерия түрінің қайсыбір варианттарын ғана залалдайтын фагтар да кездеседі. Оларды сол түр ішінде фаготипті (фаговариантты)  анықтау үшін қолданады. Сонымен қатар, бақтериялардың туыстас түрлерін де лизистеуші фагтар кездеседі. Тәжірибелік жұмыста фагтар мыналар үшін қолданылады:

   

а) бактерияларды фаготиптеуде, яғни бактериялардың сол бір түрінің штаммдарын типоспецификалық фагтармен лизистенуі бойынша фаготипті анықтау. Бұл аурулардың эпидемиологиялық талдамасы кезінде зерттелетін бактерияларды таңбалау үшін маңызды;

б) түрлік тегін айқындау мақсатында бактериялық дақылдарды фагоидентифи- кациялауда;

в) науқас организмінен (мысалы, нәжістен) фагты бөліп алумен шектелетін фагодиагностикада. Бұл материалда сәйкес бактерияның бар-жоқтығын жанама түрде айғақтайды.

г) фагопрофилактикада – эпидемиялық ошақта жүрген адамдар арасында қайсыбір аурулардың (мысалы, дизентерияның) алдын алуда.

д) фаготерапияда – мысалы, шигеллалардан, протеялардан, стафилококктардан туындаған қайсыбір инфекциялық ауруларды емдеуде.

 

▲ Әдістемелік нұсқаулар

Қоршаған орта объектілерінен фагтарды бөліп алу. Вирулентті фагты алу үшін бастапқы материалды (су, нәжіс суспензиясы және т.б.) бактериялық сүзгіден өткізе отырып, сүзінді дайындайды. Сүзіндіні сәйкес бактерия дақылымен бірге бульонға құйып, 18-24 сағатқа 37°С-қа инкубациялайды. Дақылдың лизисінен соң қалған бактериялық жасушаларды центрифугалау немесе бактериялық сүзгіден сүзу арқылы бөліп тастайды. Сүзіндідегі фагтың бар-жоқтығын сандық және сапалық әдістермен анықтайды.

E. coli фагтарын анықтаудың  сапалық әдістері. Қоректік агары бар Петри табақшасына ішек таяқшасының тәуліктік сорпалық дақылын газон түрінде себеді де 10-15 минуттай 37°С-та кептіреді. Сонан соң, газон беткейіне жайылып ағатындай етіп фаг тамшысын ендіреді. Термостатта тәулік бойы инкубациялаған соң фаг тамшысы ізімен пайда болған лизис аймақтарына зейін қоя отырып, табақшаны қарап шығады.

Сандық әдіс – фаг титрін Грация әдісі бойынша анықтау. Тәжірибені жасау алдында атқарылатын жұмыстар: а) қоректік агарды Петри табақшасына құйып, термостатта кептіреді; б) дайындалып, 3-4 мл-ден шыны түтікшелерге құйылған жартылай сұйық (0,7%) қоректік агарды су моншасында жібітеді. Зерттелетін фагқа натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде 10 мәртелік сұйылту ( 10-2, - 10-7 ұйғарылған титрге байланысты) жүргізеді. Сонан соң фагтың соңғы (10-7) сұйылтпасынан 0,5 мл алып, сондай мөлшердегі фагқа сезімтал бактерияның тәуліктік сорпалық дақылымен араластырады да 45°С-қа дейін суытылған жартылай сұйық агары бар шыны түтікшеге құяды. Араласпаны дереу Петри табақшасындағы агар беткейіне құяды, ол  осы жерде жұқа қабат түрінде қатып қалады. Осылайша фагтың келесі (10-6) сұйылтпасынан араласпа жасап, оны да агар беткейіне құяды. Одан соң осы жұмысты 10-5 сұйылтпамен қайталайды. Агардың екінші қабаты қатқан соң табақшаларды 37°С-та инкубациялайды да фагтың негативті колонияларын санайды. Бұл колониялардың саны себілген араласпадағы фагтар санына сәйкес келеді. Осыдан фагтың бастапқы суспензиясының 1 мл-дегі дақ түзуші бірлектерінің санын есептеп шығаруға болады. Фагтың концетрациясын сипаттаушы осы өлшем титр деп аталады. (5.3.1 кесте).

Фагтың лизистік әсерінің спектрін анықтау. Зерттелетін бактериялық дақылдардың саны бойынша қоректік агары бар Петри табақшасын квадраттарға сызып бөледі. әрбір квадратқа сәйкес сорпалық дақылдың тамшысын құрықпен ендіреміз де сол квадраттың аумағында оны жаямыз. Одан соң әрбір себілген квадратқа құрықпен немесе пастерлік тамызғышпен зерттелетін фагты бір тамшылап тамызамыз. Термостатта тәулік бойы инкубациялаған соң табақшаны қарап, бактериялық газондағы бактериялардың тұтастай лизисі немесе стерильді дақтары бар квадраттарды белгілейміз. Зерттелетін фагпен лизистенген сан-алуан бактериялық дақтар саныменен оның лизистік әсер спектрін анықтаймыз.

 

Кесте 5.3.1. Грациа әдісі бойынша фагтарды титрлеудің нәтижелері ( хаттама қалыбы)

 

Зерттелуші сынама нөмірі	Сынамаларды сұйылтпаларда себу кезінде алынған фагтардың "стерильді" дақтарының саны			1 мл-дегі фагтық денешіктер саны
	10-5	10-6	10-7
1 2 3	370 463 37	42 50 4х	3 6 0	7,3 х 107 1,0 х 108 7,7 х 106

 

Бактерияларды фаготиптеу. Зерттелетін бактерияның тәуліктік сорпалық дақылын Петри табақшасындағы қоректік агар беткейіне газон түрінде сеуіп, аздап термостатта кептіреміз де квадраттарға бөліп, оның әрқайсысына пастер тамызғышымен бір тамшыдан әртүрлі типоспецификалық фагтарды ендіреміз. Тәуліктік инкубациядан соң табақшадағы бактериялардың тұтастай лизисі бар квадраттарды белгілейміз. Бактериялық дақылдың фаготипі оның лизисін тудыратын фагпен анықталады (5.3.2. сурет)

Лизогенияны анықтау. Фагтарды бактериялардан айыру үшін зерттелуші тәуліктік сорпалық дақылды центрифугалаймыз. Фагты айқындау үшін тұнба үстілік сұйықтықты индикаторлық (сезімтал) бактериялық дақыл газонына себеміз. Одан 1 тәулік 37°С инкубациядан соң лизис ошақтары – "стерильді" дақтар пайда болады. Тәжірибенің теріс нәтижесі кезінде зерттелетін бактериялық дақылды ондағы профагты индукциялау мақсатында алдын-ала УК-сәулелермен өңдейді.

 

 

Тарау  6               МИКРООРГАНИЗМДЕР   ГЕНЕТИКАСЫ

 

Кіріспе. Бактерияның геномы модульді құрылымға ие. Оның құрамына микроб жасушасының хромасомасы, әлсіз бактериофагтар, плазмидалар, транспозондар және IS-элементтер жатады. Бактерияның бейімделушілігін қамтамасыз ететін геном құрамы тұрақтылығының демеуленуі, оның көбею кезіндегі туындалуы және өзгергіштігі түрдің сақталуындағы міндетті жағдайлар болып табылады. Геном тұрақтылығының демеулену негізінде репликация ферменттерінің және қайсыбір ДНҚ репарациясы жүйесінің жұмысы жатыр. Генетикалық ақпараттың өзгеруі мутация мен рекомбинация салдарынан туындайды. Мутациялар шығу тегі бойынша әртүрлі (спонтанды және индукцияланған) болып келе отырып, жасуша ішіндегі ДНҚ –ның өзгеріске ұшырауын алып келеді. Рекомбинация қоршаған ортадан келіп түсетін басқа да жасушалар мен вирустардың ДНҚ –ын қолдануға мүмкіндік береді.

 

Тақырып 6.1 МОДИФИКАЦИЯЛЫҚ ӨЗГЕРГІШТІК, МУТАЦИЯЛАР, РЕКОМБИНАЦИЯ ЖӘНЕ БАКТЕРИЯЛАР АРАСЫНДАҒЫ ГЕНДЕР ТАСЫМАЛДАНУЫ.

 

▲  Әдістемелік нұсқаулар

Трансформация тәжірибесін жасау. (жапсырмадағы 6.1 суреті). Реципиент – Bacillus subtilis Strs штаммы (стрептомицинге сезімтал таяқша); донор - Bacillus subtilis  Strr (стрептомицинге тұрақты) –тен бөліп алынған ДНҚ. Рекомбинанттарды (трансформанттарды) таңдауға арналған селективті орта – 100 ЕД/мл стрептомицині бар қоректік агар. Bacillus subtilis–тің 1мл сорпалы дақылына 1мкг/мл донор ДНҚ-ын қосамыз. Қоспаны 37°С-та 30 минут инкубациялаймыз. Онан соң реципиент штаммының бактериялық жасушасына енбеген ДНҚ-ын жою үшін  пробиркаға  0,5 мл магний хлориді ерітіндісіндегі 0,1 мкг/мл ДНҚаза ерітіндісінің қоспасын енгіземіз де 5 минуттай ұстаймыз. Түзілген стерептомицинтұрақты рекомбинанттар (трансформанттар) санын анықтау үшін 0,1 мл сұйытылмаған қоспаны Петри табақшасындағы селективті ортаға себеміз. Реципиент дақылының жасушалар санын анықтау үшін натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде 10–5–10–6 дейін (колониялардың саналынатын мөлшерін алу үшін) 10-мәртелік сұйылтпа дайындаймыз, 0,1 мл-ден стрептомицинсіз қоректік агарға, ал бақылау үшін – стрептомицині бар агарға себу жасаймыз. Соңғы ортада реципиентті дақыл өспеуі тиіс, өйткені ол стрептомицинге сезімтал. Себіндіні 37°С-та инкубациялаймыз. Келесі күні тәжірибе нәтижесін қорытындылайды  да өсіп-өнген рекомбинантты жасушалар санының реципиент штамдары жасушасына қатынасы бойынша трансформация жиілігін анықтайды.

Мысалыға, 10–5 сұйылтпасындағы реципиент штаммының 0,1 мл дақылын себу жасағанда 170 колония, ал сұйытылмаған қоспаның 0,1 мл-ін себкенде рекомбинантты штаммның 68 колониясы өсіп өнді делік. Әрбір колония бір бактериялық жасушадан түзілгендіктен реципиенттің 0,1 мл себілген дақылында 170х105 өміршең жасушалар, ал 1 мл-де – 170х106, немесе 1,7х108 жасушалар бар деген сөз. Осы тұрғыда 0,1мл қоспада 68 рекомбинантты жасуша, 1 мл-де – 680, немесе 6,8х102 бар болғаны. Осылайша бұл тәжірибедегі трансформация жиілігі мына формуладағы көрсеткіштерге тең болады:

 

           6,8 х 102

                     =  4,0 х 10–6.

1,7 х 108

 

Спецификалық трансдукция тәжірибесін жасау (жаспсырмадағы 6.2 суреті). Реципиент – лактоза ферментациясын қадағалаушы β-галактозидазалық оперонынан айырылған E. coli lac– . Трансдуцирлеуші фаг – геномындағы гендердің бір бөлігі E. coli-дің β-галактозидазалық оперонымен алмастырылған  λ dgal  фагы. Ол ақаулы, яғни ішек таяқшасының лизисімен аяқталатын өнімді инфекция тудыра алмайды және де геномындағы бактериялық оперон gal-мен қоса d әріпімен ( dgal  фагы) белгіленеді. Селективті орта – Эндо ортасы, мұнда реципиентті штаммның лактозатеріс бактериялары түссіз, ал лактозаоң колониялары металл жалтырағы бар қызыл колониялар түзеді. Реципиентті штаммның 3 сағаттық сорпа дақылының 1 мл-не 1 мл трансдукциялаушы  dgal фагын қосамыз. Оның концентрациясы 1 мл-де 106 – 107 бөлшекке тең. Қоспаны 37°С та 60 минут бойы инкубациялаймыз да одан колониялардың саналынатын мөлшерін алу үшін 10-мәртелік сұйылтпасын (алынатын бактерияның концентрациясына байланысты) дайындаймыз. 10–6 сұйылтпасы бар шыны түтікшеден Эндо ортасы бар 3 Петри табақшасына дақылды 0,1 мл-ден себеміз де сұйықтықты орта беткейіне шпательмен жаямыз. Себіндіні 1 тәулік инкубациялаймыз да, тәжірибе нәтижесін қорытындылап, барлық табақшалардағы рекомбинант (трансдуктант) жасушалар мөлшерінің реципиенттік штаммдар жасушалары санына қатынасы арқылы трансдукция жиілігін есептеп шығарады. Мысалы, 10–6 сұйылтпасындағы аралас дақылдың 0,1 мл-ін Эндо ортасы бар 3  Петри табақшасына себу жасағанда  әрбірінде реципиент штаммының  138, 170 және 160 түссіз колониялары пайда болды, бірінші табақшада 5 және соңғы табақшада 1 қызыл түсті трансдуктан колониялары түзілді. Осыған орай бұл жағдайда трансдукция жиілігі мына формуладағы көрсеткіштерге тең:  

 

(5+1) х 10 х 106		6
	=		= 1,3 х 10-2
(38+170-     160) х 10 х 106		468

                                           Лейцин синтезін қадағалаушы Leu гені бар хромосома фрагментін тасымалдау мақсатында конъюгация тәжірибесін жасау  (жапсырмадағы 6,3 сурет). Донор – E. coli K12 Hfr leu +  Str s штаммы; реципиент – E. coli K12 F– leu + StrR . Мұндағы Hfr – рекомбинацияның жоғары жиілігі тән жағдайдың белгіленуі. Рекомбинанттарды бөліп алуға орналған селективті орта – минимальді глюкозатұзды орта: KH2PO4 – 6,5 г,  MgSO4 – 0,1 г,  (NH4)2SO4 – 1 г, Ca(NO3)2 – 0,001г, FeSO4 – 0,0005г, глюкоза – 2г, стрептомицин 200 ЕД/мл, дистильденген су – 1л.