Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

      Дифференциалды-диагностикалық орталар микробтардың жекеленген түрлерін (немесе топтарын) ажырата білу (дифференциациялау) үшін қолданады. Бұл орталарды құрау принципі ферменттер жиынтығының біркелкі болмауы салдарынан бактериялардың әртүрлі түрлерінің биохимиялық белсенділігінің өзгеше болуына негізделген.

     Дифференциалды-диагностикалық  орталарға мынадай компоненттер  кіреді:

а) бактериялардың көбеюін қамтамасыз ететін негізгі қоректік орта; б) белгілі бір көмірсу (мысалы, лактоза), бактерияның оны пайдаға асыру қабілеті сол түрге тән диагностикалық белгі болып саналады; в) түрлі түсті индикатор (мысалы Андраде индикаторы), оның түсінің өзгеруі сәйкес көмірсуды ферментациялау салдарынан рН ортасының қышқыл жаққа ауытқуының айғағы бола алады. Дифференциалды-диагностикалық орталар лабораториялық, микробиологиялық, диагностикалық зерттеулерде бактериялардың дифференцияциясы мен идентификациясы үшін кеңінен қолданылады.

      Бактерияларды дақылдау, негізінен, таза дақылдарды бөліп алу және идентификациялау үшін қолданылады. (схема 3.1)

    ▲ Бактериялардың  таза дақылын бөліп алу.

      Әдетте, құрамында  әртүрлі микроорганизмдер араласпасы  бар зерттеу материалынан бактериялардың  жекеленген түрлерін бөліп алу  әртүрлі мақсаттарда жүргізілетін (аурудың диагностикасы, қоршаған ортаның микробтық ластануын анықтау және т.б.) кез-келген бактериологиялық зерттеулер кезеңдеріның бірі болып келеді. 

      Таза дақыл дегеніміз - қоретік ортада өсірілген бір түрге немесе түрлемге жататын бактерияның популяциясы. Бактериялардың көптеген түрлері бір белгісі бойынша биологиялық варианттарға – биоварға бөлінеді. Биохимиялық қасиеттері бойынша ажыратылатын биоварларды хемоварлар,  антигендік қасеттері бойынша ажыратылатындарды – сероварлар, фагқа сезімталдылығы бойынша – фаговарлар және т.б. деп бөледі. Әртүрлі көздерден не бір көзден,  бірақ әртүрлі уақытта бөліп алынған сол бір түрдің немесе биовардың микроорганизмдерының дақылы штаммдар деп аталады, оларды, әдетте, нөмірлермен немесе символдармен белгілейді.

     Колониялар - тығыз ортада (беткейінде немесе оның қойнауында) бір бактериялық жасушаның көбеюі нәтижесінде түзілген микроорганизмдердің бір түрінің жәй көзге көрінетін оқшауланған қауымдастығы.

 

 

    

Сурет 3.1.1. Бактериялық колониялардың типтері.

а- тегіс жиекті, дөңгелек; б – дөңгелек, томпиған, жалтыраған, кілегейлі қойыртпақ; в – тегіс емес жиекті; г – шеткері белдемесі бар, дөңгелек; д – түйіршікті; е – жалпақ жапырақтәрізді; ж – тарамдалған; з – қатпарлы.

▲ Таза дақылды бөліп алу әдістері

      Таза дақылды бөліп  алу үшін мыналарға негізделген  әдістер қолданылады:

1.  Бактериялық жасушаларды механикалық  жекелеуге;

2. Зерттелетін материалға таңдамалы  антибактериялық әсер беретін  физикалық немесе химиялық факторлармен  алдын ала өңдеуге;

3. Себінділерді инкубациялау кезінде  бірге өсуші микрофлораның көбеюін  физикалық немесе химиялық факторлармен  таңдамалы түрде тежеуге;

4. Кейбір бактериялардың өздеріне  сезімтал зертханалық жануарларда  жылдам көбею қабілетіне (биосынама).

      Таза дақылды бөліп алу, әдетте, 3 кезеңнен тұрады:

1. Зерттелуші материалдан бактериялардың оқшауланған колонияларын алу;
2. Таза дақылды жинақтау мақсатында әрбір типті колониядан материалды ауыстыра себу;
3. Бөлінген таза дақылды идентификациялау.

 Патогенді бактериялардың көбісі жылдам өсетін болып келеді. Олардың қоректік орталардағы көзге көрінетін өсімі 18-24 сағаттан соң байқалады. Мұндай бактериялардың таза дақылын бөліп алудың ұзақтығы 2-3 тәуліктен аспайды. Баяу өсуші микробтарды дақылдағанда (мысалы туберкулез қоздырғышын) бұл мерзім 4-6 аптаға, тіпті оданда ұзаққа созылуы мүмкін.

 

Тақырып 3.1. БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ КӨБЕЮ, ҚОРЕКТЕНУ, ӨМІР СҮРУ

                          ТӘСІЛДЕРІ. БАКТЕРИОЛОГИЯЛЫҚ ЗЕРТТЕУ  ӘДІСТЕРІ.

                          БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ  ТАЗА ДАҚЫЛЫН БӨЛІП АЛУ.

 

▲ Әдістемелік нұсқаулар

   Негізгі орталар.

     П е п т о н д ы  с о р п а. Құрғақ күйінде шығарылады; құрамы (г/л): майшабақтың триптикалық гидролизаты – 10,05; натрии хлориді – 4,95.

     Қ о р е к т  і к  а г а р. Құрамы (г/л): жемдік ащытқылардың ферментативті гидролизаты – 12,0; агар – 12,5; натрии хлориді – 5,5; рН 7,3 ±0,1.

     Н е г і з г  і  к ү р д е л і  о  р т а л а р. – қанды, сарысулы  және асцидті. Оларды қоретік  агарға 5-10 %ті дефибринденген қан  немесе қан сарысуы, болмаса 25%ті асцид сұйықтығын қосу арқылы дайындайды. Сұйық орта дайындау үшін сондай мөлшерде қан сарысуын немесе асцид сұйықтығын қоректік сорпаға қосады.

     М ю л л е р  -  Х и н т о н   а  г а р ы  ( диск әдісі бойынша  бактериялардың антибиотиктерге  сезімталдылығын анықтауға арналған негізгі тығыз қоректік орта): 1 л дистильденген суда 300 г ет қайнатпасы (сиыр етінен), 17,5 г казеин гидролизаты, 1,5 г крахмал, 17 г агар-агар болады.

     Элективті  қоректік орталар.

     1 % ті  п е п т  о н  с у ы,  рН 8,0. Басқа бактериялардың өсуін басып озып жылдам көбейетін тырысқақ вибрионының таңдамалы ортасы. Ортаның сілтілі реакциясы тырысқақ қоздырғышының (Vibrio cholerae) өсуіне еш кедергі болмайды да осындағы басқа микроорганизмдердің өсуін тежейді.

     С і л т і л і   о р т а  (тығыз орта): Қоректік агар, рН 7,8. Жоғарыдағы қоректік ортаға ұқсас. Vibrio cholerae үшін элективті.

     Л е ф ф л е  р  о р т а с ы.  4/1 бөлігі  жылқы сарысуынан және 4/3 бөлігі  қантты сорпадан тұратын араласпа. Шыны түтікшеде Кох аппаратында қыздырып, қиғаш агар ретінде дайындайды. Дифтерия қоздырғыштары - Corynebacterium diphtheriae үшін элективті.

     С а р ы у ы  з д ы – т ұ з д ы  а г а р  (СТА). Құрамында стафилококктардың  ғана өсуін тежемейтін натрий  хлоридінің жоғары концентрациясы (8-10%) болады. Сондықтан, осы микроорганизмдердің элективті ортасы болып келеді. Бұл қоректік орта лецитиназа өндіретін стафилококктарды осы ферментті өндірмейтін стафилококктардан дифференциациялауға да мүмкіндік береді. Лецитиназа түзуіші түрлер колониясының айналасында жылтыр қызғылт реңді лайсаңдану аймағы пайда болады (фермент 45°С қа дейін балқып суытылған қоректік тұзды агарға енгізілген тауық жұмыртқасының саруызын ыдыратады).

       Анаэробтарды дақылдауға арналған орталар.

      В и л ь с  о н – Б л е р   о р т а с ы  (темірсульфитті агар). Қоректік агардан дайындалады. Оған  глюкоза, Na2SO3, FeCІ2 қосады. Анаэробты клостридиялар (C. Perfringens) бұл ортада Na2SO3 -нің Na2S -не тотықсыздануына байланысты қара колониялар түзіледі, олар темір хлоридімен қосыла отырып қара түсті темір сульфидінің (FeS) тұнбасын береді.

     К и т т а – Т а р о ц ц и  о р т а с ы. Құрамында қоректік сорпа, 0,5% глюкоза мен оттегінің адсорбциясы үшін бауыр үзімі немесе ет фаршы болады. Себуалдында ауасын шығарып тастау үшін ортаны 10-15 минут қайнап тұрған су моншасында қыздырады. Себуден соң, ортаның бетін вазелин майының жұқалау қабатымен бетін жабады.

     Г е м и н і   б а р    т и о г  л и к о л ь д ы    с о р п а  (Bacteroides, Prevotella, Porphyomonas туысының өкілдері – спора түзбейтін анаэробтарды дақылдауға аралған элективті сұйық орта): 1л дистильденген суда 17г казеин гидролизаты, 3г соя гидролизаты, 6г глюкоза, 2,5г натрий хлориді, 0,5г натрий тиогликолаты, 0,25г L-цистеин, 0,1г натрий сульфаты, 5 мг гемин.

     Дифференциалды-диагностикалық орталар.

     Г и с с   о  р т а с ы.   1 % ті пептон  суына 0,5 % ті  белгілі-бір көмірсу (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит  т.б.) мен Андраде индикаторын ( 1 н. NaOH ерітіндісіндегі қышқыл фуксин) қосып, шыны түтікшелерге құямыз. Көмірсулар ірігенде түзілетін газтәрізді өнімдерді ұстау үшін шыны түтікшелерге қалытқылар (бір шеті тұйықталған ұзындығы 3см түтік) орналастырады. рН 7,2-7,4 те орта түссіз. Көмірсулар ірігенде оның түсі қызарады.

      Р е с с е  л ь   о р т а с ы. Энтеробактериялардың (эшерихия, шигелла, сальмонелла т.б.) биохимиялық қасиеттерін зерттегенде қолданады. Құрамы қоректік агардан, лактозадан, глюкозадан және бромитол көгі индикаторынан тұрады. 6-8 мл-ден шыны түтікшеде беткейі қиғаштанған бағана түрінде дайындалады. Себілмеген ортаның түсі шөптесін жасыл. Себуді қиғаш беткейлікке штрихпен, бағана қойнауына шанышқымен жасайды. Глюкозаны қышқылға дейін ферменттеуші микроорганизмдер ортадағы бағана бояуын бастапқы шөптесін жасыл түстен сары түске өзгертеді; қиғаш беткейлік мұнда көк түске енеді. Лактозаоң микроорганизмдер (E. coli) бағана мен ортаның қиғашталған бөлігінің түсін сарыға өзгертеді. Сілті түзуші микроорганизмдер ортаны көк түске өзгертеді. Газ түзіліуі ортаның бағана қойнауында байқалады.

     Э н д о  о  р т а с ы.  1% ті лактозасы  және натрий сульфитімен түссізденген  индикатор – негізгі фуксині  бар кептірілген қоректік агардан  тұратын ұнтақ түрінде шығарылады. Жаңа дайындалған орта түссіз  немесе бозғылт-қызғыш болады. Лактозоң  бактериялардың өсуі кезінде колониялары металдық жалтырағы бар күнгірт-қызыл түске боялады, лактозатеріс бактерияларда түссіз болады.

     П л о с к и  р е в  о р т а с ы  (Бактоагар Ж). Құрамында лактозалы  қоректік агары, бриллиант көкгі, өт қышқылының тұздары, минералды тұздар мен индикаторы (бейтарап қызыл) бар ұнтақ түрінде шығарылады. Бұл орта тек дифференциалды-диагностикалық ғана емес, көптеген микроорганизмдердің (ішек таяқшасы т.б.) өсуін тежей отырып, қайсыбір патогенді бактериялардың (іш сүзегі, сүзектектес, дизентерия қоздырғыштары) жақсы өсуіне ықпалын тигізетіндіктен селективті ортаға да жатады. Лактозатеріс бактериялар бұл ортада түссіз, лактозаоң бактериялар қызыл түсті колониялар түзеді.

      В и с м у  т – с у л ь ф и т  т і  а г а р. Құрғақ түрде шығарылады; құрамында майшабақтың триптикалық гидролизаты, глюкоза, бейорганикалық тұздар, бриллиант көгі және агар болады. Орта сальмонеллаларды бөліп алуға арналған. Ортаның дифференцияциялаушы қасиеті микроорганизмдердің  висмут цитратымен реакцияға түсіп, қара түсті қосылыс – висмут сульфитінің түзілуін туғызатын Н2S өндіру қабілетіне негізделген. Орта бриллиант көгі мен натрий сульфитінің басушы әсерінен бірлесе өсуші микрофлораның өсуін күрт тежейді.

         Микроорганизмдер дақылдарын себу және ауыстыра себу техникасы. Себулер жасауға арналған әмбебеп аспап бактериялық құрық (металдық көпреттік немесе пластмассалы бірреттік) болып табылады. Одан бөлек, жаншып себу үшін арнайы бактериологиялық ине қолданылады, ал Петри табақшасына себу үшін металдық, шынылық немесе пластикалық шпательдер қолданылады.

        Материалдарды сұйық ортаға себу үшін, құрықпен қатар, пастерлік және деңгейленген  тамызғыштар қолданады. Алғашқысын  алдын-ала стерильді жеңіл балқымалы шыны түтіктерден капилляр түрінде от жалынында соза отырып дайындайды. Капилляр шетін стерильділікті сақтау үшін бірден жапсырып тастайды. Пастерлік және деңгейленген тамызғыштардың кеңейген шетін мақтамен тығындайды да арнайы пеналдарға салады немесе қағазбен орап, стерильдейді.

       Микробтармен жүргізілетін барлық іс-шаралар оттық жалынына таяу қашықтықта, стерильді аспатардың көмегімен жүргізіледі. Металлды бактериологиялық құрықты қолданар алдында, әбір іс-шарадан соң және жұмыс соңында оттық жалынында қыздырып стерильдейді.

       Микробтарды дақылдау қоретік ортаға себу жасап, инкубациялау арқылы жүзеге асырылады. Және де ол үшін температура, ылғалдылық, атмосфераның газды құрамы т.б. аса қолайлы жағдайда болуы тиіс. Осы мақсатта микроорганизмсы бар материалды (науқастан, таза дақылдан, оқшауланған колониялардан т.б. алынған) сұйық ортаға немесе тығыз ортаның беткейіне не қойнауына орналастырады (себеді). Ыдыстарды (шыны түтікше, Петри табақшасы т.б.) алдын-ала жазумен белгілеп, себу мерзімін, себінді материалдың сипатын (зерттеу нөмірі немесе дақылдың атауы) көрсетеді. Себу техникасына және микробтардың концентрациясына байланысты тығыз қоректік ортаның беткейіне себілген бактерия біртегіс жаппай өсуі – бактериялық газон, "біріккен өсу" (микроорганизмдердің көп мөлшерін агар беткейінің шектелген бөлігіне орналастырғанда пайда болады) немесе оқшауланған колония түзе өсуі мүмкін.

     Материалды  тығыз қоректік ортаға себу  техникасы.

О қ ш а у л а н ғ а н    к о л о н и я л а р д ы    а л у.   Оқшауланған колонияларды алу үшін себу кезінде микробтарды механикалық жолмен жайып тастауға болады. Осы мақсатта құрықпен алынған материалды агар беткейіне параллель штрихтарымен орнықтырады, осылайша бактерияның концентрациясы жекеленген жасушаларға дейін азаяды.

      Тағы бір әдісі  бактериялардың аз концентрациялы суспензиясын дайындаудан тұрады. Осындай суспензияның бір тамшысын Петри табақшасындағы қоректік агар беткейіне орналастырып, стерильді шпательмен ортаның бүкіл беткейіне біртегіс етіп мұқият жаяды.

       Б а к т  е р и я л ы қ   г  а з о н   а л у. "Газонмен" себуді Петри табақшасындағы қоректік агар беткейіне шпательмен жүргізеді. Ол үшін сол қолмен қақпақшаны ашыңқырап тұрып, тұзақпен немесе тамызғышпен қоректік агар беткейіне себу материалын орнықтырады. Сонан соң, шпательді от жалынында қыздырып, қақпақшаның ішкі беткейіне жанастыра суытады да  ортаның бүкіл беткейіне