Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

      Құрықты бөгде бактерияларды жою үшін оттық жалынында қақтайды. Шыны түтікшенің тығынын V-IV саусақтар мен алақан арасына қысып, бұрап шығарады да түтікше жиегін аздап қыздырады. Құрықты абайлап түтікше ішіне ендіреді де оны шынының ішкі бетіне сүйкеп суытады. Онан соң жеңіл сырғымалы қозғалыспен материалды құрыққа жұқтырып алады да оны түтікшеден шығарып, қайтадан түтікше жиегін қыздырып, тығынды жабады. Препарат дайындап болған соң құрықты міндетті түрде от жалынында  қақтайды (стерильдейді). Шыны түтікшедегі немесе колбадағы сұйық материалды тамызғышпен де алуға болады.

      Микроорганизмдерді  тірі күйінде зерттеу үшін  нативті препараттар дайындау. "Ілінген" тамшы әдісі. Препаратты жабынды шынының ортасына бір тамшы зерттелетін материал тамыза отырып дайындайды. Онан соң, шеттеріне алдын-ала вазелин жағылған ойығы бар бұйым шынысын жабынды шыныға тамшы ортасында қалатындай етіп жапсарлаймыз да епті қозғалыспен препаратты төңкереміз. Әдіс дұрыс істеген жағдайда жабыны шыны үстіне қарап, оның астынғы беткейінде тамшы ілініп тұруы тиіс. Микроскоппен көру үшін алдымен төменгі үлкейткіштегі объективті (8х немесе 10х) пайдаланып, тамшы шетін тауып аламыз да 40х объективке немесе иммерсиялық объективке қойып, препаратты зерттейміз. Яғни, бактериялардың қозғалғыштығын анықтаймыз.

       "Жаншылған" тамшы әдісі. Майсызданған бұйым шынысының беткейіне бір тамшы зерттелетін материалды немесе бактериялардың суспензиясын ендіріп, оны жабынды шынымен жабамыз. Тамшы шыны жиегіне шықпайтындай аз болғаны дұрыс.

      Тірідей (витальді) бояу. Микроорганизмдер қоспасын  0,001 % ті метилен көгінің немесе бейтарап қызыл ерітіндісінің бір тамшысына ендіреміз. Онан соң "ілінген" немесе "жаншылған" тамшы дайындап, микроскоптайды.

      Микроскопиядан соң "ілінген" немесе "жаншылған" тамшы препараттарын дезинфекциялаушы  ерітіндіге салады.

      Бекіндірілген жағынды-препараттарды дайындау.

     Майсыздандырылған бұйым  шынысына бактерияның суспензиясын (жүзгінін) ендіреміз. Егер, жағындыны  сұйық қоректік ортадан алса, онда материалды бұйым шынысына  тікелей тамызғышпен ендіріп, жұқа  жағынды алардай етіп жаяды. Басқа жағдайларда бұйым шынысына алдымен судың немесе натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісінің тамшысын тамызып, оған зерттелетін материалды араластырамыз. Материалды дұрыс жайған жағдайда микроскопияда жағындыдан жекеленген жасушалар байқалады.  Жағындыны ауада немесе жылытылған ауа ағымында кептіреді. Және де тамшы ысып кетпейтіндей қашықтықта от жалынында да кептіруге болады.

Препаратты бекінту. Кептірілген жағындыларды термиялық немесе химиялық өңдеуден өткізеді. Нәтижесінде бактерия өледі де шыны беткейіне тығыз жабысады. Әдетте, жағындыны бекінту үшін бұйым шынысын от жалыны үстінен бірнеше рет өткізеді.

      Қан жағындыларын, мүшелердің ізтаңба-жағындыларын 5-20 минут метил немесе этил спиттеріне, болмаса басқа да бекінтушы  ерітінділерге мала отырып бекінтеді.

      Препараттарды қарапайым әдістермен бояу. Бекіндірілген жағындыны қандайда-бір бір ғана бояғышпен бояп, (мысалы сулы фуксинмен немесе метилен көгімен), кептіреді де, микроскоптайды.

      Люминесцентті  микроскопияға арналған препараттарды  дайындау және бояу. Люминесцентті микроскопия үшін бұйым шыныларында бекіндірілген жағынды-препараттарды немесе нативті препараттарды дайындап, оларды арнайы флюоресцентті бояғыштармен (акридинді сары акридинді сарғыш, ауромин, кринофосфин) бояймыз. Иммерсиялық объективпен жұмыс істегенде флюоресценцияланбайтын май қолданады.

      Электронды микроскопияға арналған препараттарды  дайындау және бояу.  Электронды микроскопта зерттеуге арналған препараттарды дайындаудың бірқатар ерекшеліктері бар. Препараттарды  арнайы қабықша-төсеніштерде дайындайды, өйткені, шыны электрондарды өткізбейді. Зерттелетін объектіні бөгде қоспалардан мейлінше тазартады да тіректі металл торшасына алдын ала орнықтырылған қабықша-төсенішке ендіреді. Контрасттілеу үшін ауыр металдардың (алтын, осмий, рутений т.б.) қосындыларын қолданады.

      Микробтық  жасушаларды өлшеу. Микробтарды өлшеу микроскопиялық зерттеу барысында арнайы қондырғылардың көмегімен жүзеге асады. Өлшеу үшін окуляр-микрометр мен объект-микрометр қолданады. Окуляр-микрометр объектіні тікелей өлшеуге негізделген, ол ортаңғы бөлімінде 50 бөліндісі бар  шкала орнатылған окулярдағы шыны пластинка ретінде берілген. Объект-микрометр - ортасында 100 бөлімге бөлінген эталонды шкаласы бар шыны ретінде берілген. Шкаланың бөліну бағамы белгілі және ол шыныда көрсетінген. Әдетте, объект-микрометр шкаласының әрбір бөліндісі 10 мкм-ге тең.

      Микроорганизмдерді  олардың бөліну бағамын алдын-ала  объект-микрометрдің көмегімен анықтап  алып, окуляр-микрометрмен өлшейді. Ол үшін объект-микрометрді микроскоптың бұйым үстелшесіне орнықтырады да үстелшені жылжытатын бұрандаларды айналдыра отырып, оның бір бөліндісі окуляр-микрометрдегі қандайда-бір бөліндіге сәйкес келуіне қол жеткізеді. Онан соң окуляр-микрометрдің бөлінді санына толығымен сай келетін объект-микрометрдің бөлінді санын белгілейміз. Объект-микрометрдің (10 мкм) бөліну көлемін біле отырып, окуляр-микрометрдің бөліну көлемін анықтаймыз. Сонан соң, объект-микрометрді зерттелуші препаратпен алмастырамыз да бактериялық жасуша өлшемін окуляр-микрометрдің линейкасымен бөліну көлемі өлшенген сол үлкейту дәрежесінде антықтаймыз.

     Микроскопиялық объектілерді  өлшеу үшін мынадай өлшем бірліктер  қолданады; 1 микрометр (мкм) =10-3 мм, 1 нанометр (нм) =10-6 мм.

     Бактериялық дақылды  зерттеу нәтижелерін 2.1.1. кестеде  көрсетілгендей хаттамалайды.

 

Тақырып 2.2. БАКТЕРИЯЛЫҚ ЖАСУШАНЫҢ МОРФОЛОГИЯСЫ МЕН

                         УЛЬТРАҚҰРЫЛЫМЫН ЗЕРТТЕУ. КҮРДЕЛІ  БОЯУ ӘДІСТЕРІ.

 

▲  Әдістемелік нұсқаулар

Күрделі бояу әдістері. Күрделі бояу әдістерін едәуір үлкен өлшемдегі бактериялық жасушаның ультрақұрылымдық құрамаларын (макрокапсуласын), талшықтарын, цитоплазмалық енбелерін т.б.) анықтау үшін және де бактерияның химиялық құрылымы мен ұсақ ұйымдасушылық ерекшелігіне байланысты дифференцияциясы (ажыратуы) үшін қолданады.

     Грам әдісімен  бояу тәсілі

1.  Бекіндірілген жағындыға сүзгіш  қағаз парақшасы арқылы генциан   

     күлгінінің карболды-спирттік  ерітіндісін ендіреміз. 1-2 минуттан  соң 

     қағазды  аламыз да шыныдағы бояуды төгіп тастаймыз.

2.  Люголь ерітіндісін 1-2 минут  ендіреміз.

3.  30-60 секунд аралығында бояғыштың  күлгін тамшылары ағып біткенше, этил 

     спиртімен түссіздендіреміз.

4.  Сумен шаямыз.

5.  1-2 минут аралығында фуксиннің  сулы ерітіндісімен толықтыра бояймыз да,

     кептіріп, микроскоптаймыз.

Грамоң бактериялар (жасушалық қабырғасы көп қабатты пептидогликаннан тұратын бактериялар) күнгірт-күлгін түске, грамтерістері (жасушалық қабырғасы бір қабатты пептидогликаннан тұратын бактериялар) қызыл түске боялады (сурет 2.2.1; жапсырмада). Бұл әдістің негізінде таңдамалы түрде түссіздендіру жатыр, яғни, генциан күлгінінің йодтық кешені спирт әсерінен жойылып кетеді. Грам әдісі бойынша бояудың нәтижесі бактерияның жасуша қабырғасының құрылымы мен химиялық құрамының ерекшеліктерімен анықталып, оның бояу кезінде түзілген генциан күлгіннің йодтық кешенін ұстап тұру қабілетіне тәуелді болады.

      Фирмикутты бактериялар  грамоң боялады, себебі, оларда тейхой  қышқылымен байланысқан көпқабатты  пептидогликан болады. Тейхой қышқылы  жасуша қабырғысында бояғыштың берік бекіндірілуіне және оның спирттпен түссізденуге тұрақтылық қасиет көрсетуіне себепкер болады. Грациликуттер грамтеріс боялады.

      Грам әдісімен  бояу елеулі дифференциациялы-диагностикалық маңызға ие және де микробиологияда кеңінен қолданылады. Грамоң бактерияларға стафилококктар, стрептококктар, коринебактериялар т.б. жатса, грамтерістерге гонококктар, менингококктар, ішек таяқшасы т.б. жатады. Бактериялардың кейбір түрлері (клостридиялар, гарднереллалар) дақылдың жасына, дақылдану ерекшелігіне және басқа да жасуша қабырғасының құрылымына әсер ететін факторларға байланысты Грам әдісінде құбылмалы боялады.

      Грам әдісімен  бояуда жіберілетін негізгі қателік, жағындыны этил спиртімен шамадан тыс түссіздендіріп қою. Грамоң бактериялар мұндайда өзерінің бастапқы генциан күлгін бояуын жоғалтып алып, келесі бояуды (фуксинді)  қабылдағандықтан қызыл түске ие (грамтеріс бактерияларға тән) болуы мүмкін. Ал, спирттпен шамасына жеткізбей түссіздендіргенде грамтеріс бактериялар генциан күлгін түсін сақтап қалуы да мүмкін. Дұрыс бояу үшін түссіздендіру техникасын қатаң сақтау керек.

     Грам әдісін Грегерсен тестімен алмастыруға болады. Оның артықшылығы, нәтиже алу үшін микроскоп пен баяғыш заттарды қажет етпейді. Бұйым шынысына орнықтырылған КОН-інің 3%-ті сулы ерітіндісінің бір тамшысына бактериялық колониядан алынған жағындыны эмульгациялаймыз (ендіреміз). Оны құрықпен бірнеше секунд араластыра отырып, құрықты сыртқа қарай тартамыз. Егер араласқан кілегей құрыпен созылып жатса, колонияны құраушы бактерия грамтеріс бактериаялардың өкілі, ал кілегей бірден үзіліп кетсе, грамоң бакерияның өкілі болғандығы. Бұл әдіс бактерияның морфологиялық қасиетін анықтауға мүмкіндік бермейді.

      Қышқылға  тұрақты бактерияларды Циль-Нильсен әдісімен бояу тәсілі

1. Бекіндірілген жағындыға филтрлеуші  қағаз парақшасы арқылы фуксиннің  корболды ерітіндісін ендіріп, бу  пайда болғанша 3-5 минут қыздыру.

2. Қағазды алып, жағындыны сумен  шаю.

3. Түссісдендіру үшін 1-2 минут 5 %-ті күкірт қышқылы ерітіндісін немесе 3 %-  ті спирттің хлорсутегі қышқылымен араласпа ерітіндісін ендіру.

4. Сумен шаю.

5. Жағындыны 3-5 минут аралығанда  метилен көгінің сулы ерітіндісімен  бояу.

6. Сумен шаю, кептіру, микроскоппен  көру.

      Бұл әдістің негізін бояғыштың сіңірілуін күшейту үшін бактерияның жасушалық қабырғасын борпылдақ күйге айналдыру мен қышқылдың әсерімен таңдамалы түрде түссіздендіру құрайды. Бактериялардың қышқылға тұрақтылығы жасушалық қабырғалары құрамында көп мөлшерде липидтердің (тарамдалған май қышқылдары - микол қышқылдары, глико- және фосфолипидтер, жалбыздар (воск)) болуымен ерекшеленетін құрылымға иелігіне байланысты. Қышқылға тұрақты бактериялардың жасушалық қабырғалары өте төмен өткізгіштікке ие, сондықтан олар бояғыштарды нашар қабылдайды. Корбол қышқылының ерітіндісі жасушалық қабырғаны борпылдандырып, тинкториялыққ қасиетті жоғарылатады, ал бояғыштың жоғары концентрациясы мен ысыта бояу үрдісінде бояғыш пен жасуша қабырғасы арасындағы қарым-қатынас реакциясын күшейеді де, бактериямыз қызыл түске боялып шығады. Препаратты күкірт қышқылымен өңдегенде қышқылға тұрақсыз бактериялар түссізденнді де, әрі қарай метилен көгімен бояғанда көгілдір түске ие болады, ал қышқылға тұрақты бактериялар фуксинге боялған күйде қызыл түсте қала береді (сурет 2.2.2.; жапсырмада).

      Ожешко әдісімен спораларды бояу тәсілі 

1. Бекідірілмеген жағындыға 0,5 %-ті  хлосутегі қышқылының ерітіндісін  ендіріп, 2-3 минут от жалынында  қыздыру.

2. Қышқылды төгіп, препаратты сумен  шаю, кептіру, от жалынында бекінту.

3. Циль-Нильсен әдісімен бояу.

      Бактериялардың споралары  қызыл түске, ал вегетативті формалары  көк түске боялады (сурет 2.2.3: жапсырмада). Бактериялардың споралары бояғыштарды  мүлдем дерлік өткізбейтіндей  күрделі құрылымды көпқабатты жасушалы қабырғадан тұрады, сондықтан олардың тинкториялық қасиеттерін арттыру үшін қышқылға тұрақты бактерияларды бояғандағындан да қатаң борпылдақтандыру жағдайын қолдану керек.

      Шеффер-Флутон әдісі бойынша спораларды бояу тәсілі

1. Бекіндірілген жағындыға 5 % -ті малахит жасылы ерітіндісін ендіріп, бу пайда болғанша 3-4 мәрте қыздыру.

2. Сумен шаю.

3. 5 % -ті сафранинмен 30 секунд аралығында  бітіре бояу.

4. Сумен шаю, кептіру, микроскоппен  көру.

Бактериялардың споралары жасыл түске, вегетативті жасушалар қызыл түске боялады.

     Нейссер әдісі бойынша волютин дәндерін бояу тәсілі

1. Бекіндірілген жағындыға Нейссер  көкшесінің ацетатын 2-3 минут ендіру.

2. 10-30 секунд Люголь ерітіндісін  қосу.

3. Препаратты сумен шаю.

4. Везувиннің немесе хризоидиннің сулы ерітіндісімен 0,5-1 минут арлығында бітіре бояу.

5. Препаратты сумен шаю, кептіру, микроскоппен көру.

      Волютин дәндері  полифосфат енбелері ретінде  болады. Цитоплазмамен салыстырғанда  сілтілі реакцияға ие, сондықтан  да  күнгірт-көк түске бояла отырып көкше ацетатын таңдамалы түрде қабылдайды. Қышқыл реакцияға ие жасуша цитоплазмасы сілтілі бояғыш - везувинді қабылдайды сары түске боялады (сурет 2.2.4; жапсырмада).

      Бурри-Гинс әдісімен макрокапсуланы табу тәсілі 

  1. Микроб жасушасының қоспасы мен туш тамшысын бұйым шынысы беткейінде араластырып, қырғыш жиегі бар шынымен оның бетін сыдырып өту, кептіру, бекінту.

2. Жағындыға фуксиннің сулы  ерітіндісін 1-2 минут ендіру.

3. Сумен шаю, ауада кептіру, микроскоппен  көру.

     Бактериялар қызыл түске боялады, капсулалар анилин бояғыштарын қабылдамай мөлдір күйде қалады да айналасы қара түсте болады (сурет 2.2.5; жапсырмада).

 

 

Тақырып 2.3. АКТИНОМИЦЕТТЕР МЕН СПИРОХЕТАЛАРДЫҢ

                          МОРФОЛОГИЯЛЫҚ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ ЖӘНЕ