Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

УК-сәулелердің антибактериялық әсерін түйсіне білу.  Натрий хлориднің изотоникалық ерітіндісіндегі стафилококктың немесе ішек таяқшасының 1 мл көлемдік суспензиясын шырағдан жарығынан 10-20 см қашықтықта орналастырамыз. Бактериялардың сәулеленген және сәулеленбеген (бақылау) суспензияларын қоректік сорпаға сеуіп, 16-24 сағат бойы 37°С-қа орналастырған соң нәтижені бағалаймыз: орта лайсаңданбаса сәулеленген бактериялар дақылының жойылғандығы, ал бақылау ортасындағы лайсаңдану өсудің жалғасып жатқандығының айғағы.

Антисептикалық және дезинфекциялаушы заттардың антимикробты әсерін анықтау. 

1. Тест-объектілердің екі түрін  дайындау: а) E.coli  дақылына шыланған  жібек жіптер; б) спора түзуші  бактериялар дақылына (споралары  көп болғаны жөн) шыланған жібек  жіптер. Жіптерді фенолдың (5%), лизолдың (5%), хлорлы әктің ерітінділеріне (10%) 5 және 60 минутқа орналастырғын соң зерттелуші заттарды шайып тастаймыз да жіптерді қоректік сорпаға салып, келесі күнге дейін термостатқа қоямыз. Бақылау сынамаларына химиялық заттарды жолатпаймыз. Қойылған тәжірибе нәтижесін жазып, қорытынды жасаймыз.

2. Сүзгі қағаздарынан жасалған  дисклерді зерттелуші заттардың  ерітінділерімен шылаймыз да  Петри табақшасындағы стафилококтың  немесе ішек таяқшасының тест-дықылы  себілген (газон түрінде) қоректік  агар беткейіне орналастырамыз. Табақшаны тәулік бойы 37°С-та инкубациялаймыз. Зерттелуші заттардың антибактериялық әсерін диск айналасында түзілген бактерия өсуінің тежелу аймағының  диаметрі арқылы бағалаймыз.

 

 

Тақырып 7.2. АНТИМИКРОБТЫ ПРЕПАРАТТАРДЫҢ ӘСЕР ЕТУ

                          ЭФФЕКТВТІЛІГІН БАҒАЛАУ ӘДІСТЕРІ

 

Кіріспе. Антимикробты препаратттарды (табиғи және синтетикалық антибиотиктерді) микроорганизмдердан туындаған ауруларды емдеу үшін қолданады. Терапияның жағымды болуы үшін сол инфекцияны тудырушы қоздырғышқа қатысты едәуір белсенді қасиетке ие және адамның қалыпты микрофлорасына мейлінше аз зиян келтіруші препаратты таңдай білу қажет. Көптеген препараттарға әртүрлі дәрежеде тұрақты (полирезистентті) бактериялық штаммдардың кеңінен таралуы бактериялардың емдік препараттарға сезімталдылығын сандық (сериялық сұйылту әдісі) және сапалық (диск әдісі) бағалауды айрықша актуальді етіп отыр. 

▲ Әдістемелік нұсқау

Сериялық сұйылту әдісімен бактериялардың антимикробты препараттарға сезімталдылығын сандық анықтау. Бұл әдіс минимальді басушы концентрацияны ― зерттелуші бактерияның өсуін толық тежейтін антибиотиктің ең аз концентрациясын анықтау үшін қолданылады. Құрамында белгілі-бір концентрациялы (мкг/мл немесе ДБ/мл) препараты бар антибиотиктің негізгі ерітіндісін физиологиялық немесе буферлік ерітіндіде немесе арнайы еріткіште дайындайды. Негізгі ерітіндіні қоректік ортада – сорпада (1мл көлемдегі) немесе агарда антибиотиктің сериялық (екі мәртелік) сұйылтпасын дайындау үшін қолданады. Зерттелуші бактериялық дақылдан стандартты тығыздықты суспензия дайындап, әртүрлі концентрациялы антибиотиктері бар 0,1 мл-лі орталарға және де препарат қосылмаған ортаға ( бақылау дақылы) себеді. Себінділерді 20-24 сағат (кейбір баяу өсуші бактериялар үшін одан да көп уақытқа) 37°С-та инкубациялайды, артынан қоректік сорпаның лайсаңдануын немесе агардағы колониялардың пайда болуын бақылау ортасымен салыстыра отырып тәжірибе нәтижесін жасайды. Зерттелуші дақылдың өсуін толығымен тежейтін  антибиотиктің ең аз концентрациясын МБК ретінде қабылдайды.

Сериялық сұйылту әдісін кез-келген өсімтал бактериялардың және баяу өсетіндерін және де облигатты жасушаішілік паразиттердің (хламидиялар, риккетсиялар мен вирустардың)  антибиотиктерге сезімталдылығын анықтау үшін қолдануға болады. Абсолютті жасушаішілік паразиттердің антибиотиктерге сезімталдылығын анықтау үшін әртүрлі концентрациядағы антимикробты препараттарды жасушалар дақылдайтын орталарға қосады да ол жасушаларды тестіленуші вирустың немесе хламидиялар мен риккетсиялардың таза дақылымен залалдайды. Нәтижені залалданған жасушаларда жинақталған қоздырғыш антигендерін табуға мүмкіндік беретін ЦПӘ бойынша немесе серологиялық реакциялар көмегімен бағалауға болады (№10-шы тарауды қара).  Осы мақсатта көбінесе иммунофлюоресцентті әдіс (ИФ) қолданылады. ЦПӘ-нің дамуына немесе жасушалардағы қоздырғыштар антигендерінің жинақталуына кедергі жасаушы препараттың ең аз концентрациясын МБК ретінде қабылдайды.

Антимикробты препараттарға сезімталдылықты анықтауға арналған микротест-жүйелер. Микротест-жүйелер бактериялардың белгілі-бір түрлерінің немесе туыстас топтарының антибиотиктерге клиникалық сезімталдылығын жылдам анықтауға арналған. Тестіленуші препараттар стандартты концентрацияда дайын пластикалық планшеттердің ойығында орналастырылған. Зерттелетін дақылдың сезімталдылығын әрбір антибиотиктің екі концентрациясына анықтайды: орташа терапиялық және максимальді. Оқшауланған колониядан алынған материалды өлшеуішті бактериологиялық құрықтың көмегімен индикаторы бар 5мл-лік стандартты қоректік ортаға ендіреді де суспензия дайындайды. Дайындалған бактериялық суспензияны планшет ойықтарына 0,1мл-ден құяды да осы бактерияның түріне лайықты температурада және ортаның газды құрамында инкубациялайды. Бактерияның өсуін индикатор түсінің өзгеруі бойынша айтуға болады, бұл зерттеу мерзімін қысқартуға мейлінше мүмкіндік береді. Егер бактериялар антибиотик бола тұра өміршеңдіктерін сақтаса, олардың метаболизм өнімдері индикатор түсінің өзгеруіне әкеп соғады. Түстің өзгермеуі микробтың өміршеңдігінің толығымен тежелгендігінің айғағы. Нәтижені 4 сағаттық инкубациядан соң спектрофотометр көмегімен анықтайды.

Бактериялардың антимикробты препараттарға клиникалық сезімталдылығын диск әдісі арқылы анықтау (диффузды тест). Бұл әдіс диск қағаздарына сіңірілген антибиотиктердің әсерінен бактериялардың тығыз ортады өсуінің тежелуіне негізделген. Препараттың агарға диффузиясының нәтижесінде диск айналасында антибиотиктің концентрациялық градиенті пайда болады. өсудің тежелу аймағының өлшемі бактерияның сезімталдылығына және препарат қасиетіне (көбіне, агарға диффузиялану жылдамдығына) байланысты. Клиникалық практикада сезімталдылықты анықтау үшін антибиотиктердің мөлшері қатаң сақталған дайын стандартты дискілер пайдаланылады. Препараттың құрамы әрбір антибиотиктің терапиялық концентрациясына және патогенді бактериялар үшін МБК-ң орташа мәніне байланысты анықталады. Препараттың аталуы мен оның мөлшері әбір дискіде жазылады. Сезімталдылықты анықтау үшін зерттелуші бактериялық дақылдан құрамында өміршең жасушалардың стандартты мөлшері бар сұйылтпа жасайды да Петри табақшасындағы Мюллер-Хинтон немесе АГВ (антимикробты заттардың диффузиясын бөгемейтін және оларға негативті әсер етпейтін) орталарына газон түрінде себеу жасайды. Бактерия себілген беткейлікке дискілерді аппликатор көмегімен табақша орталығынан 2,5 см қашықтықта айналдыра орналастырамыз (сурет 7.2.1). Табақшаға 5 дискіден артық орналастырмайды. Себінділерді 18-20 сағат 35°С-та инкубациялайды.процедураны тиянақты орындағанда біркелкі бактериялық газон аясында дискілердің айналасында өсудің тежелу аймағы пайда болады.

Нәтиже санағы өсудің тежелу аймағының диаметрін өлшеу арқылы жүзеге асырылады. Бактериялар өсуі толық байқалмайтын аймағы ғана өлшенуге тиесілі болып саналады.

Диск әдісін пайдалануда бірқатар шектеулер бар. Бұл әдіс құрамында   антибиотиктердің белсенділігін төмендетуге қабілетті заттары жоқ немесе олардың диффузиясына кедергі болмайтын, едәуір қарапайым құрамды (Мюллер-Хинтон немесе АГВ) стандартты тығыз қоректік ортада 24 сағаттың ішінде гомогенді газон түзетін, жылдам өсуші бактериялардың сезімталдылығын анықтау үшін ғана жарамды. Олай болмаған жағдайда алынған ақпарат жалған болуы мүмкін.

 

                          

           Сурет 7.2.1. Бактериялардың   антибиотиктерге   сезімталдылығын анықтау. Диск әдісі.

 

 Осылайша, диск әдіс барлық  баяу өсуші және көптеген өсімтал  бактериялардың антибиотиктерге  сезімталдылығын анықтау үшін  қолданылмайды. Ол бактерияларға  адамның көптеген ауруларының  қоздырғыштары (Mycobacterium spp., Helicobacter spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Brucella spp., Mycoplasma spp. және көптеген басқалар) жатады. Өздеріне арнап стандартты тестілер жасалған кейбір өсімтал бактериялардың (Haemophilus spp., Neisseria spp., стрептококктардың белгілі-бір түрлері) сезімталдылығын анықтағанда арнайы қоректік орталар мен алынған нәтижелердің интерпритациясы кезінде қосымша критериилер қолданған жөн.

Сонымен қатар, бактериялардың агарға нашар диффузияланушы препараттарға (мысалы, полипептидті антибиотиктер – полимиксин, ристомицин) сезімталдылығын анықтағанда да диск әдісі сенімді нәтиже бермейді.

Бактериялардың антимикробты препараттарға сезімталдылығын Е-тест көмегімен сандық анықтау.  Е-тест антибиотиктердің МБК-ын анықтауға мүмкіндік беретін диффузды әдіс варианты ретінде берілген. Дисклердің орнына арнайы технологиямен даярланған (AB BIODICK) және құрамында концентрацияның үздіксіз градиенті түрінде енгізілген иммобилизацияланған антимикробты препараты бар стандартты полимерлік жолақшалар қолданылады. Е-тесті жолақшасының қарсы бетіне МБК мәні бар шкала енгізілген. Жолақшаны агар беткейіне орықтырғанда диффузияның реттелуші үрдісі қоректік ортадағы жолақша айналасында шкалаға сәйкес, препарат концентрациясының стабильді градиентінің түзілуін қамтамасыз етеді. Е-тесттің көмегімен сезімталдылықты анықтау процедурасы диск әдісімен тестілеуге ұқсас жүргізіледі. Нәтижелерді итерпритациялау үшін (клиникалық сезімталдылығын бағалау) стандартты критериилар қолданылады (кесте 7.2.3).

 

Кесте 7.2.3. Сериялық сұйылту әдісі арқылы антимикробты препараттардың МБК-ын анықтау.

 

Шыны түтікшелер нөмірі	Антибиотиктің сұйылтпалары	Антибиотиктің концентрациясы мкг/мл	Бактериялардың өсуі (ортаның лайсаңдануы
1 2 3 4 5 6 7	1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Антибиотиксіз орта (бақылау)	100 50 25 12,5 6,25 3,12 -	- - - - + + +

 

 

Тарау 8        МИКРООРГАНИЗМДЕР ЭКОЛОГИЯСЫ

 

Кірспе. Микроорганзмдер экологиясы жалпы микробиологияның бөлімі ретінде белгілі-бір биотопта бірлесе мекендеуші микро- және макромикроорганизмдердың өзара қарым-қатынасын зерттейді. Микробтар шынайы мекен ету ортасында (топырақта, суда, ауада, жануарлар ағзасында) әртүрлі биоценоздар құрамына кіреді. Адамда ауру туғызушы микробтар экологиясы олардың сыртқы ортада сақтала өмір сүруге, иелерін ауыстыруға, иммунды жүйенің әсерінде бола тұра ие ағзасында тұрақтауға қабілеттілігімен анықталады. Сонымен қатар, микробтардың экологиясы олардың таралу, тасымалдану және басқа да факторларымен тығыз байланысты. Бірқатар экологиялық жағдайларды бағалау санитарлы микробиологияның басты міндеттерінің бірі болып келеді.

Санитарлы-бактериологиялық зерттеулер гигиенист-дәрігерлер мен эпидемиологтардың тәжірибелік жұмысының негізін құрайды. Олар қоршаған орта объектілеріне, тағам өнімдеріне, сусындарға және т.б.  санитарлы-гигиеналық баға бере отырып, инфекциялық аурулар профилактикасында жетекші роль атқарады. Медициналық микробиологиялың маңызды зерттеу объектісі - адамның қалыпты микробиологиясы болып табылады. Оған тері жабындысында, әртүрлі мүшелердің (ауыз, көмей, мұрынжұтқыншақ, жоғары тыныс жолдары, ішек, әсіресе тоқ ішек және т.б қуыстары) кілегейлі қабықшасында мекендейтін микробтар жатады. Олардың қайсы-бірі адам ағзасының тұрақты (облигатты) мекендеушілері болса, енді бірі – уақытша (факультативті немесе транзиторлы) мекендеушілері болып келеді. Қалыпты микрофлора – бұл ағзаның өмірлік маңызды жүйесі болып табылады. Ол ағзаның көптеген патогенді микробтардан қорғанысын, иммунды жүйенің жетілуі мен стимуляциясын, асқортылуға қатысатын бірқатар витаминдер мен ферментердің өндірілуін және т.б. қамтамасыз етеді. Адам микрофлорасының сандық және сапалық құрамы өмір бойы оның жынысына, жасына, тамақтану сипатына т.б. байланысты өзгеріп отырады. Сонымен қатар, адам микрофлорасы құрамындағы өзгерістер аурлардың пайда болуынан, дәрілік заттардың, әсіресе антибиотиктер мен иммуномодуляторларды қолдануынан да туындайды. Адам микрофлорасының сандық және сапалық құрамын белгілі-бір көрсеткіштер бойынша  бағалау оның бұзылуын (дисбактериоз) және онымен байланысты салдарды анықтауға мүмкіндік береді.

 

Тақырып 8.1. АУАНЫҢ, СУДЫҢ ЖӘНЕ ТОПЫРАҚТЫҢ

                          МИКРОФЛОРАСЫ. СУДЫ, АУАНЫ ЖӘНЕ ТОПЫРАҚТЫ 

                         САНИТАРЛЫ-БАКТЕРИОЛОГИЯЛЫҚ ЗЕРТТЕУ  ӘДІСТЕРІ

 

▲ Әдістемелік нұсқау

●   Қоршаған ортаны микробиологиялық зерттеу әдістері.

          Қоршаған ортаның әртүрлі объектілерінің, ауыз суының, тағам өнімдерінің және т.б. санитарлы-гигиеналық жағадайын бағалау үшін, эпидемиялық қауіптілігін анықтауды мақсат тұта отырып, оларға санитарлы-бактериологиялық зерттеулер жүргізеді. Бірақ, әдетте, қоршаған орта объектілерінде (ауа, су, топырақ) көбеюге бейімсіз және ондағы концентрациясы да аз болатын болғандықтан, кейбір патогенді микробтарды анықтау бірқатар қиындықтарды туғызады. Сондықтан, санитарлы-микробиологиялық тәжірибеде жанама әдістер қолданады. Ол қандай да бір объектідегі жалпы микробтық тұқымдануды және ондағы санитарлы-көрсеткіш бактериялар (8.1.1 кесте) ретінде қарастырылатын  микробтарды анықтауға негізделген.

     Микробтық тұқымдануды  микробтық сан арқылы айқындайды. Микробтық сан – зерттелуші объектінің көлемдік немесе массалық бірлігінде (1мл суда, 1г топырақта,1м3 ауада) табылатын микробтардың жалпы мөлшері. Санитарлы-көрсеткіш бактериялардың мөлшерін екі көрсеткіш – титр және индекс бойынша бағалайды. Титр ретінде құрамынан санитарлы-көрсеткіш бактериялар табылатын, зерттелуші материалдың минимальді көлемін немесе массасын қабылдайды;  индекс - 1 л сұйықтықта, 1г тығыз затта, 1м3 ауада болатын санитарлы-көрсеткіш бактерияларды көрсетеді. Санитарлы-көрсеткіш бактерияларға адамдар мен жылы қанды жануарлардың ішегінде немесе респираторлы жолдарында мекендейтін облигатты микрофлора өкілдері жатады. Оларға мынадай қасиеттер тән; 1) ағзадан үнемі үлкен мөлшерде сыртқы ортаға бөлінеді; 2) басқа мекен ету ортасы болмайды; 3) сыртқы ортада сақталу ұзақтығы ішекте немесе респираторлы жолда паразитті өмір сүруші патогенді бактериялармен бірдей; 4) Ие организмінен тыс қандайда-бір объектідеинтенсивті көбеюге және қасиеттерін өзгертуге қабілетсіз. Аталған бнлгңлнр қоршаған ортаның әртүрлі объектілері үшін санитарлы-көрсеткіш болып табылатын бірқатар бактерияларға тән (8.1.1. кестені қара).

Қоршаған ортаның нәжістік ластануына айғақ болар санитарлы-көрсеткіш бактерияларға ішек таяқшасы тобының бактериялары (ІТТБ) жатады. Олар Enterobacteriaceae әулиетінің әртүрлі туыстарынан тарайды. ІТТБ дифференциалды-диагностикалық белгілері 8.1.2. кестеде көрсетілген. Қоршаған ортаның қандайда-бір объектісінен немесе тағам өнімдерінен E.coli табылып жатуы,  таяуда ғана нәжіспен ластанудың едуәр нақты көрсеткіші бола алады. Enterobacter мен Citrobacter туыстарының бактериялары табылса біршама ертеректегі нәжіспен ластануды меңзейді.

        Топырақта Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes және басқа клостриядиялар кездессе жаңадан да, ертеректе де нәжіспен ластанудың айғағы

бола алады, себебі, бұл бактериялар қоршаған ортада (көбінесе топырақта) ұзақ сақталуларына мүмкіндік беретін споралар түзеді. Қоршаған орта объектілерінде Enterococcus faecalis- тің табылуы да нәжіспен ластанудың айғағы. Термофильді бактериялар тобына 60°С және жоғары температурада көбеюге қабілетті, әртүрлі әулиеттерден тараған туыстас емес бактериялар жатады (laktobacillus lactus, Streptococcus thermophilus және б.). Олар адам ішегінің тұрақты мекендеушілері емес және де қоршаған ортаның нәжістік ластану критериилері бола алмайды. Бұл бактериялар мөлшерінің күрт өсуі топырақтың шірінді қоқыстармен ластанғандығына айғақ бола алады, өйткені, олар өздігінен қызатын қилар мен көңдерде көбейеді. Enterobacteriaceae әулиетінің Proteus туысына (Proteus vulgaris және б.) жататын бактериялар табиғатта кеңінен тараған. Бұл шірінді бактериялар жануарлар мен өсімдіктердің ыдыраушы қалдықтарында кезедеседі. Бұл бактериялардың қандайда-бір тағам өнімдерінде табылуы шіріндік ыдыраудың айғағы.