Производство алкогольных напитков

3. Фруктозо-6-фосфат  под действием фермента фосфофруктокпназы присоединяет по месту первого углеродного атома второй остаток фосфорной кислоты за счет АТФ и превращает в фруктозо-1,6-дифосфат. Эта реакция практически необратима. Молекула сахара переходит в оксоформу и становится лабильной, способной к дальнейшему превращению, так как ослабляется связь между третьим и четвертым углеродными атомами.

4. Под действием фермента  альдолазы (активируемой ионами Zn2+, Со2+ и Са2+) фруктозе-1,6-дифосфат распадается на две фосфотриозы — З-фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. Эта реакция обратима.

5. Между фосфотриозами происходит реакция изомеризации, катализируемая ферментом триозофосфатизомеразой. Равновесие устанавливается при 95% 3-фосфоглицеринового альдегида и 5% фосфодиоксиацетона.

6. В индукционный период, пока в качестве промежуточного  продукта не образовался уксусный  альдегид, между двумя молекулами 3-фосфоглицеринового альдегида  под действием фермента альдегидмутазы при участии молекулы воды происходит реакция дисмутации. При этом одна молекула фосфоглицеринового альдегида восстанавливается, образуя фосфоглицерин, другая окисляется в 3-фосфоглицериновую кислоту. Фосфоглицерин в дальнейших реакциях не участвует и после отщепления фосфорной кислоты является побочным продуктом спиртового брожения.

При установившемся процессе окисление 3-фосфоглицеринового альдегида в 3-фосфоглицериновую кислоту происходит сложным путем. Вначале он превращается в 1,3-дифосфоглицериновый альдегид, присоединяя остаток неорганической фосфорной кислоты, затем под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы в присутствии НАД (никотинамидадениндинуклеотида) окисляется в 1,3-дифосфо-глицсриновую кислоту. НАД, вступая в соединение со специфическим белком, образует анаэробную дегидрогеназу, обладающую способностью отнимать водород непосредственно от фосфоглицеринового альдегида и других органических соединений.

7. При участии  фермента фосфотрансферазы остаток фосфорной кислоты, содержащий макроэргическую связь, передается с 1,3-дифосфоглицериновой кислоты на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты. Энергия, освобождающаяся при окислении фосфоглицеринового альдегида, резервируется в АТФ.

8. Под действием фермента  фосфоглицеромутазы 3-фосфоглицериновая кислота изомеризуется в 2-фосфоглицериновую кислоту.

9. В результате  отдачи воды, вызываемой перераспределением  внутримолекулярной энергии, 2-фосфоглицериновая  кислота превращается в фосфоэнолпировиноградную кислоту, содержащую макроэргическую связь. Реакцию катализирует энолаза, активируемая ионами Мg2+, Мn2 + и Zn2+.

Максимальное действие энолазы проявляется в интервале рН 5,2—5,5. При рН 4,2 молекулы энолазы агрегируются, при рН 3—4 необратимо денатурируются.

10. Под действием фермента фосфотрансферазы в присутствии ионов К+ остаток фосфорной кислоты передается от фосфоэнолпировиноградной кислоты на АДФ, резервируя энергию в АТФ.

11. Образовавшаяся энолпировшюградная кислота превращается в более стабильную кетоформу.

12. Под действием фермента  карбоксилазы от пировиноградной  кислоты отщепляется диоксид  углерода и образуется уксусный  альдегид.

13. Фермент алкогольдегидрогеназа переносит водород с восстановленного НАД-Н2 на уксусный альдегид, в результате чего образуется этиловый спирт и регенерируется НАД. 

 

АЭРОБНЫЙ РАСПАД УГЛЕВОДОВ

В условиях аэробиоза распад углеводов до образования пировиноградной кислоты происходит так же, как и при анаэробиозе, но в отличие от него пировиноградная кислота полностью окисляется до диоксида углерода и воды в цикле трикарбоновых кислот — ЦТК (цикле Кребса, лимоннокислотном цикле). В этом цикле последовательно протекают окислительно-восстановительные реакции, в которых под действием специфических дегидрогеназ происходит перенос водорода на молекулярный кислород — конечный его акцептор. Однако перенос осуществляется не непосредственно, а через молекулы-переносчики, образующие так называемую дыхательную цепь. Схема химических превращений при аэробном распаде глюкозы приведена ниже.  

 

При катаболизме глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты. Вначале одна из них подвергается реакциям окислительного декарбоксилирования, в результате которых образуется ацетил-КоА (активированная уксусная кислота): 

СНз · СО ·  СООН + КоАSН + НАД — СНз-СО ~ КоАSН + НАД · Н2 + СО2  

 

Вторая молекула пировиноградной кислоты под действием фермента пируваткарбоксилазы конденсируется с молекулой диоксида углерода с образованием щавелевоуксусной кислоты: 

 

СHз · CO · COOH + CO2  +  АТФ   ↔   HOOC · CH2  · CO ·  COOH  + АДФ  +  Ф 

 

При установившемся цикле щавелевоуксусная кислота образуется из яблочной (малата).

Собственно ЦТК начинается с конденсации ацетил-КоА с молекулой щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетата), катализируемой ферментом цитратсинтазой. Продуктами реакции являются лимонная кислота (цитрат) и свободный кофермент А: 

 

 

 

Дальнейшие превращения видны из схемы на рисунке.

За один оборот молекулы пировиноградной кислоты присоединяется 3 молекулы Н2О, выделяется 5 Н2 и образуется 3 молекулы СО2:

СНз  · СО  · СООН +  ЗН2О  — >   ЗС02    +   10 Н.

В ЦТК «сжигаются» не только углеводы, но и жирные кислоты (после предварительной деградации до ацетил-КоА), а также многие аминокислоты (после удаления аминогруппы в реакциях дезаминирования или переаминирования).

Аэробный и анаэробный распад углеводов доставляет дрожжам энергию и обеспечивает процессы синтеза биомассы различнымипредшественниками. Из щавелевоуксусной и а-кетоглутаровой кислот в результате восстановительного аминирования и переаминирования образуются соответственно аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Аспарагиновая кислота может образовываться также из фумаровой кислоты. Синтез этих двух аминокислот занимает главное место в синтезе белков из углеводов. При конденсации фосфодиоксиацетона с альдегидами могут образовываться пентозы, гексозы и различные полисахариды. Для синтеза биомассы дрожжи используют и другие — анаплеротические — пути, например пентозофосфатный путь. Пентозофосфаты являются предшественниками нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Так как при полном окислении сахара значительно больше освобождается энергии и образуется реакционноспособных метаболитов для синтетических процессов, то возрастает скорость размножения и увеличивается биомасса дрожжей. 

 

РАСХОД САХАРА НА БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ПРОДУКТЫ БРОЖЕНИЯ

Дрожжегенерирование — сложнейший биохимический процесс, состоящий из взаимосвязанных и тесно переплетающихся биохимических реакций, поэтому точно рассчитать расход питательных веществ на продукты дрожжегенерирования невозможно. В приближенных теоретических расчетах пользуются суммарными уравнениями процессов брожения и биосинтеза.

Анализ различных способов получения дрожжей из мелассы показывает, что наибольший экономический коэффициент — процент сахара, израсходованного на получение товарной продукции, за вычетом потерь — получается при спиртовом брожении с утилизацией дрожжей (64,6%). На специализированных дрожжевых заводах экономический коэффициент ниже (42—45%).

 

     В процессе дрожжегенерирования сахар расходуется на получение трех основных продуктов: дрожжей, спирта и диоксида углерода. Чтобы максимально использовать сахар, необходимо утилизировать все названные продукты. При спиртовом брожении сахар, например, содержащийся в мелассе, расходуется на образование следующих веществ: этилового спирта (46—47,6%); диоксида углерода [в соответствии с количеством этилового спирта (44 — 45,5%)]; биомассы дрожжей (1,8—4%); глицерина (3,2—4,5%); высших спиртов (0,28—0,7%); альдегидов (0,1—0,2%); органических кислот (0,2—1%). Потери несброженного сахара в бражке 2,1—2,8%. Общие потери сахара в процессе сбраживания 7—12% к введенному в производство. Соответственно и выход спирта составляет 88—93% к теоретическому.

На количество образовавшегося при спиртовом брожении глицерина влияют состав сбраживаемой среды и ее физико-химические показатели.

Расход сахара на образование биомассы дрожжей и их жизнедеятельность зависит от направленности процесса. Так, при работе по схеме с выделением дрожжей из зрелой мелассной бражки и использованием их в качестве хлебопекарных стремятся накопить возможно больше дрожжей. Дрожжи можно многократно возвращать на сбраживание, что сокращает расход сахара на образование биомассы дрожжей. Энергия брожения дрожжей при их 2— 4-кратном возврате не только не снижается, но даже несколько повышается. Кроме того, при многократном использовании увеличивается общее число дрожжевых клеток и возрастает интенсивность брожения.

При сбраживании сусла в зрелой бражке содержится 20—35 г дрожжей 75%-ной влажности в 1 л. В условиях анаэробного дыхания на образование 1 г дрожжей указанной влажности расходуется 0,4 г сахарозы, следовательно, на получение 20—50 г дрожжей потребляется 8—14 г сахара, или 6—11%.

На дыхание дрожжей при дрожжегеперировании в спиртовом производстве расходуется значительное количество сахара — 6—15% от общего его расхода в этом процессе, или 2—5% от всех сбраживаемых Сахаров, содержащихся в среде дрожжегенераторов. Расход сахара на дыхание при различных условиях дрожжегенерирования неодинаков и зависит от его концентрации в среде, скорости насыщения среды кислородом, температуры и других условий. Поэтому есть еще значительные резервы повышения выхода спирта при переработке мелассы.

Согласно уравнению брожения в этиловый спирт переходит 66,7% углерода сахара, в CO2 — 33,3%. Соотношение между количествами углерода, идущими на построение биомассы и на дыхание, непостоянно и зависит от концентрации сахара в среде, температуры и других условий. С повышением концентрации сахара от 1 до 4% количество углерода, используемого на построение биомассы, увеличивается с 52—55 до 60-61% и соответственно уменьшается на образование С02 при дыхании, т. е. процесс становится более экономичным.

С понижением температуры среды значительно уменьшается удельный расход сахара на дыхание: при 30°С он равен 0,22, при 20°С — 0,13, при 15°С — 0,075 г на 1 г прессованных дрожжей. При 36°С удельный расход сахара на дыхание также ниже, чем при 30°С (0,2 г/г).

Коэффициенты полезно использованного углерода при концентрации сахара в среде 2,2% и температурах 15, 20, 25, 30 и 36°С соответственно равны 71,6; 67,4; 60,7; 58,5 и 62,7%.

С повышением интенсивности окислительных процессов (с увеличением интенсивности аэрации) выход дрожжей по массе сахара, израсходованного в процессе биосинтеза, уменьшается. 

 

 

  

 

 

              МИКРООРГАНИЗМЫ — СПУТНИКИ ДРОЖЖЕЙ

При сбраживании сусла дрожжами необходимо предохранять их от посторонних микроорганизмов — бактерий и «диких» дрожжей, вносимых с сырьем, водой и воздухом. Попадая в дрожжевые и бродильные аппараты, они могут накапливаться в значительных количествах и даже вытеснить производственную культуру дрожжей. Инфицирующие микроорганизмы потребляют из сусла часть питательных веществ, что снижает выход спирта. Кроме того, они образуют органические кислоты и другие продукты, инактивирующие ферменты осахаривающих материалов и снижающие бродильную энергию дрожжей, в результате чего в зрелой бражке повышается количество несброженных Сахаров и крахмала. Хлебопекарные дрожжи, выделенные из инфицированной мелассно-спиртовой бражки, имеют низкую ферментативную активность и стойкость-

 

                       

 

 

 

                               ОПИСАНИЕ ПОСТОРОННИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Молочнокислые бактерии

Молочнокислые бактерии бывают цилиндрические или палочковидные и сферические или шаровидные (кокки), грамположительные, неподвижные, неспорообразующие. Гетероферментативные молочнокислые бактерии наряду с молочной кислотой образуют летучие кислоты, спирт, диоксид углерода и водород.

Оптимальная температура для роста большинства молочнокислых бактерий 20—30°С. Термофильные виды их лучше развиваются при 49—51°С. Молочнокислые, как и другие бесспоровые, бактерии погибают при 70—75°С.

Наиболее часто встречаются следующие виды молочнокислых бактерий: Lacto. bacillius plantarum, Lact. breve, Lact. fermentii, Leuconostoc mesenterioides, leuc. agglutinans. Первые три — палочки различной длины, последние два — очень короткие палочки, чаще дипло- и стрептококки. Бактерии Leuconostoc mesenterioides имеют слизистую капсулу, поэтому очень устойчивы к высокой температуре и кислотам. В жидких средах погибают при 112—120°С в течение 20 мин; в 0,5%-ном: растворе серной кислоты жизнеспособны в течение 1 часа. Бактерии Leuc. agglutinans обладают способностью прилипать к дрожжам и склеивать (агглютинировать) отдельные их клетки. 

 

Уксуснокислые бактерии

Уксуснокислые бактерии — грамотрицательные, палочковидные, бесспоровые, строго аэробные организмы, развивающиеся в тех же условиях, что и дрожжи. Бактерии способны окислять этиловый спирт в уксусную кислоту, пропиловый спирт — в пропионовую кислоту, бутиловый спирт — в масляную кислоту. Некоторые виды бактерий способны окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу и арабинозу — в ксилоновую и арабановую кислоты. Этиловый спирт является главным источником жизнедеятельности уксуснокислых бактерий.