Технология производства инсулина

 

 

Технология  производства инсулина

 

 

 

Введение 

 

Глава 1. Литературный обзор

 

1.1.Получение инсулина 

 

1.2.Препараты инсулина 

 

 

        1.3. Шприцы,  шприц-ручки и дозаторы инсулина 

 

 

        1.4.Техника  инъекции инсулина………………………………………..

 

 

        1.5.Факторы,  влияющие на всасывание и действие  инсулина………..

 

 

        1.6. Осложнения  инсулинотерапии……………………………………..

 

 

       1.7. Упаковка  инсулина 

 

 

        1.8. Хранение  инсулина. 

 

 

        1.9. Современные  пути совершенствования инсулинотерапии…..

 

Глава 2. Экспериментальная  часть

 

Заключение 

 

Литература 

 

 

 

 

Введение:

Инсулин (от лат. insula -- остров) -- гормон пептидной  природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях.

 

Основная функция инсулина - обеспечивать проницаемость клеточных  мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые  питательные вещества в конечном счете расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций - митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.

 

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток -- абсолютная недостаточность инсулина -- является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани -- относительная инсулиновая недостаточность -- имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

 

Число больных диабетом во всем мире составляет 120 млн. (2,5% населения). Каждые 10-15 лет количество больных  удваивается. По оценке Международного института диабета (Австралия), к 2010 году в мире будет 220 млн. больных. В  Украине насчитывается около I млн. больных, из которых 10-15% страдает наиболее тяжелым инсулинозависимым диабетом (I типа). В действительности число  больных в 2-3 раза больше за счет скрытых  недиагностированных форм.

 

История открытия инсулина связана с именем русского врача  И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным  гормоном поджелудочной железы.

 

В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему  мальчику, больному диабетом. результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

 

 

 

 

После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько  лет пройден огромный путь его  выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных  сахарным диабетом 1 типа.

 

В 1935 году датский исследователь  Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получиь гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

 

В начале 70-х г.г. советскими учеными  А.Юдаевым и С. Швачкиным был  предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.

 

В дальнейшем шло прогрессирующее  улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные  инсулиновой аллергией, нарушениями  работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.

 

В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать  с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

 

 

 

 

Цель моей работы: Изучение препаратов инсулина представленных на нашем рынке, их преимущества и недостатки.

 

Задачи: Рассмотрение технологического процесса получения инсулина в промышленном производстве.

 

 

 

 

Глава 1. Литературный обзор

 

1.1  Получение инсулина

 

Инсулин человека можно производить  четырьмя способами:

 

1)  полным химическим синтезом;

 

2)  экстракцией из поджелудочных  желез человека (оба этих способа  не подходят из-за неэкономичности:  недостаточной разработанности  первого способа и недостатка  сырья для массового производства  вторым способом);

3)  полусинтетическим методом  с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;

 

4)  биосинтетическим способом  по генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

 

Рассмотрим получение инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

 

Итак, преимущества получения  инсулина биосинтетическим путем.

 

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

 

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч  голов свиней (если известно, что  годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

 

Биосинтетический метод  получения инсулина стал применяться  в начале 80-х годов

 

(восьмидесятых годов).

 

Остановимся на схеме получения  рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

 

1.  этап Путем химического  синтеза были созданы последовательности  нуклеотидов,  которые кодируют  образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

 

2.  этап. Каждый из синтетических  генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3.  этап. Вводят ген,  кодирующий образование фермента  бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.

 

4.  этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

 

5.  этап. Помещают две культуры  в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.

 

6.  этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

 

7.  этап. Окисляют остатки  цистеина, связывают и получают  инсулин.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Инсулин, полученный этим путем  является человеческим инсулином по своей структуре, что с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций.

 

Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гельпроникающей, анионообменной).

 

В Институте РАН получен  рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli, метод заключается в синтезе его биологического предшественника проинсулина, и позволяющий не проводить раздельного синтеза А и В цепей инсулина. Для выработки проинсулиновой части молекулы в Е.coli. вводят плазмиду (ее получают путем встраивания природной или чужеродной ДНК - так получают рекомбинантную молекулу РНК). Плазмида обеспечивает синтез рекомбинантного белка, представляющего собой лидерную последовательность и фрагмент белка, а также проинсулин человека с находящимися между ними остатком метионина (аминокислота). Проинсулиновую часть молекулы отделяют обработкой бромцианом в уксусной кислоте (расщепление идет избирательно - по остатку метионина). Смесь (проинсулиновая часть и лидерная последовательность) разделяют хроматографически. На следующем этапе в полученной последовательности проинсулина осуществляют правильное взаимное расположение цепей А и В, что выполняет центральная часть — пептид С. На следующем этапе ферментативным способом вычленяют связывающий С пептид. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получаю человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности. 

Контроль  качества генноинженерного инсулина предполагает контроль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др.

 

 

 

 

1.2  Препараты инсулина

 

Препараты инсулина различаются  по источнику получения. Инсулин  свиньи и быка отличается от человеческого по аминокислотному составу: бычий - по трем аминокислотам, а свиной - по одной. Неудивительно, что при лечении бычьим инсулином побочные реакции развиваются гораздо чаще, чем при терапии свиным или человеческим инсулином. Эти реакции выражаются в иммунологической инсулинорезистентности, аллергии к инсулину, липодистрофиях (изменении подкожножировой клетчатки в месте инъекции).

 

Несмотря на явные недостатки бычьего инсулина, он все еще широко используется в мире. И все же недостатки бычьего инсулина в иммунологическом плане очевидны: его ни в коем случае не рекомендуется назначать  больным впервые выявленным сахарным диабетом, беременным или для кратковременной инсулинотерапии, например в периоперационном периоде. Отрицательные качества бычьего инсулина сохраняются и при использовании его в смеси со свиным, поэтому смешанные (свиной+бычий) инсулины также не стоит использовать для терапии указанных категорий больных.

 

Препараты инсулина человека по химической структуре полностью  идентичны человеческому инсулину.

 

Основной проблемой биосинтетическиго метода получения инсулина человека является полная очистка конечного продукта от малейших примесей использованных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Новые методы контроля качества гарантируют, что биосинтетические инсулины человека вышеперечисленных производителей свободны от каких-либо вредных примесей; таким образом, их степень очистки и сахароснижающая эффективность отвечают самым высоким требованиям и являются практически одинаковыми. Каких-либо нежелательных побочных действий, зависящих от примесей, эти препараты инсулина не имеют.

 

 

 

 

Препараты инсулина в зависимости от начала и длительности действия делятся  на следующие группы: 

1) инсулины быстрого и сверхкороткого действия; 2) инсулины короткого действия («простые» инсулины); 

3) инсулины средней продолжительности действия («промежуточные» инсулины); 

4) инсулины длительного действия; 

5) «смешанные» инсулины — комбинация инсулинов разной продолжительности действия.

 

Количество препаратов инсулина, имеющих разные названия, составляет несколько десятков, и ежегодно добавляются  новые названия инсулинов различных  зарубежных, а в последние годы и отечественных фармацевтических фирм

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Инсулины  быстрого и сверхкороткого действия  

 

 

 

 

Инсулины быстрого и сверхкороткого действия включают в настоящее время три новых  препарата — лизпро (хумалог), аспарт (ново рапид, новолог) и глюлизин (апидра). Их особенность — в более быстром начале и окончании действия по сравнению с обычными, «простыми» ин-сулинами человека. Быстрое наступление глюкозоснижающего эффекта новых инсулинов обусловлено их ускоренным всасыванием из подкожно-жировой клетчатки. Особенности новых инсулинов позволяют уменьшить промежуток времени между их инъекциями и приемом пищи, снизить уровень послепищевой гликемии и уменьшить частоту возникновения гипогликемии.

 

Начало действия лизпро, аспарта и глюлизина происходит в диапазоне от 5 до 10—15 минут, максимальный эффект (пик действия) — через 60 минут, продолжительность действия — 3 — 5 часов. Эти инсулины вводят за 5 — 15 минут до еды или непосредственно перед ней. Установлено, что введение инсулина лизпро сразу же после еды также обеспечивает хороший контроль гликемии. Однако важно помнить, что введение этих инсулинов за 20 — 30 минут до еды может приводить к гипогликемии.

 

Больным, переходящим  на введение указанных инсулинов, надо чаще контролировать уровни гликемии, пока они не научатся соотносить количество потребляемых углеводов и дозы инсулина. Таким образом, дозы препаратов устанавливаются  в каждом конкретном случае индивидуально.