Использование заквасок в хлебобулочных изделиях

     Преимущества  этого способа иммобилизации  заключается в прстоте методики, возможности создать иммобилизованные препараты любой геометрической конфигурации (сферические частицы, пленки), высокая химическая, механическая и тепловая стойкость, неоднократность использования. Метод универсален, т.к. применен для иммобилизации практически любых фрагментов и целых клеток. Ферменты надежно защищены от бактериального загрязнения. Вместе с тем метод имеет и недостатки: полимерная матрица создает препятствия для диффузии субстрата к ферменту, что снижает его каталитическую активность; если субстратом является ВМС, то метод вообще не применим. 

     Иммобилизация ферментов с использованием мембран. Существует несколько способов:

• Микрокапсулирование. Метод разработан в 1964 г. Т. Чангом. Изготавливаются микрокапсулы размером от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, толщина мембран составляет десятые – сотые доли мкм. При диаметре пор – несколько нм. Внутри этих микрокапсул находятся ферменты, например, аспарагиназа.
• Двойное эмульгирование. Приготавливают эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера. Ее вновь диспергируют, но в воде. В результате получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента. Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с включенным в них ферментов.
• Включение в волокна. Водный раствор фермент в органическом растворе волокнообразующего полимера (целлюлоза, поливинилхлорид и др.) продавливают через фильтры в жидкость (толуолом), вызывающую коагуляцию полимера. Таким образом для проведения фундаментальных исследований, ибо липосомы по своей природе близки природным биомембранам.

     Преимущества  ИФ с применением мембран: простота и универсальность, высокое содержание включенного фермента, сохранение его каталитической активности. Однако при иммобилизации  с помощью мембран затруднено ферментативное превращение ВМС. 

     Использование систем двухфазного  типа. При этом субстрат под действием фермента перерабатывается в водной фазе, а продукт экстрагирует в фазу органического растворителя. Подобным образом можно гидролизовать крахмал под действием смеси амилазы и амилоглюкозидазы в двухфазной системе из водных растворов крахмала и полиэтиленгликоля. Этот метод применяется сравнительно редко, так как для него характерна низкая скорость процесса, инактивация фермента при его адсорбции на границе раздела фаз, загрязнение продукта и другое.

• изготавливают, например ткань, обладающую ферментативной активностью (хирургические салфетки с иммобилизованным трипсином).
• Включение в липосомы. Ферменты,иммобилизованные этим методом, применяются, главным образом, в медицинских целях, а также

     2.2 Химические

     Принципиальным  является то, что путем химического воздействия на структуру фермента, в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Такие препараты обладают двумя свойствами:

     ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность конъюгата;

     существенно изменяется субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность фермента.

     При химической иммобилизации используются различные носители, от которых  фермент отдален благодаря «ножке». Для этого применяют сшивающие  агенты различной  длины, часе всего это глутаровый альдегид:  

     Они могут быть простыми бифункциональными и сложными полуфуекциональными.  Благодаря «ножке» нет тесного соприкосновения фермента с носителем, в результате сохраняется нативная конформация биокатализатора. В процессе ковалентной иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы фермента, которые несущественны для его функции. Эти группы должны быть высокореакционноспособными, их нужно много для обеспечения широких возможностей введения новых химических связей в белковую молекулу. Наиболее реакционносапособными группами в белках являются SH- группы цистеина. Они участвуют в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и т.д. Однако в белках свободных SH- группы или нет, так как они участвуют в образовании дисульфидных мостиков, или они необходимы для каталитической активности фермента. Исходя из этого для иммобилизации, часто используют аминогруппы фермента, их много, они достаточно реакционноспособны, обычно играют второстепенную роль в поддержании структуры и функции ферментов. Если аминогруппы нужны для катализа, то их легко защитить, наконец, для аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и сшивающих реагентов. В реакциях модификации могут также участвовать имидазольные, гуанидиновые и гидроксильные группы. Всегда следует помнить, что белок очень лабилен, поэтому условия проведения иммобилизации должны быть мягкими и неденатурирующими.

     Всегда  следует помнить, что белок очень  лабилен, поэтому условия проведения иммобилизации должны быть мягкими  и неденатурирующими.

     В настоящее время используют следующие  приемы химической иммобилизации ферментов:

     -реакция  образования амидной связи. Здесь  часто применяют реакцию ацилирования аминогрупп фермента, используя ангидриды: 

                               О

                               II

                               С о

 

     и хлорангидриды карбоновых кислот:

           О                                          О

          II                II

(НзС)— С—С1 + Н₂N – Ф НзС— С—NH - Ф

• реакция образования карбамидных связей. Для этого часто используют бромциановый метод. При обработке бромцианом на природных носителях (или синтетических полиолах) образуются очень реакционноспособные цианатные, —О—С=N. и имидокарбонатные,

       

С = NH, группы.

               О

     При взаимодействии белка с таким  активированным носителем образуются изомочевины (1) и уретаны (2). 
 
 

 
 
     

• реакции образования  вторичных аминов, а- и в- Аминогруппы белков можно трансформировать во вторичные в реакциях алкилирования и арилирования, а так же путем восстановления азометиновых связей (оснований Шиффа). Алкилирующими и арилирующими агентами служат галогенпроизводные алифатических и ароматических углеводородов, а также метилалканов:

 

     В таких условиях алкилируются тиольные, имидазольные и гидроксильные группы. Окислительное арилирование осуществляют с помощью бензохинона:

                 О                                                                                                               

+ Н N – Ф 

  

                     O

                    

               

                 О 

     NH - Ф 

                O 

     - реакции тиол-дисульфидного обмена. Принцип иммобилизованных ферментов основан на формировании межмолекулярных дисульфидных связей:

     СН — SH + HS — Ф CH — S—S—Ф

     Для увеличения числа тиольных групп восстанавливают дисульфидные связи боргидридом натрия, меркаптоэтанолом, цистеином и другое, вводят эндогенные тиогруппы (тиолирование), например, превращая в них аминогруппы;

     - модификация аминогрупп с образованием  азометиновых связей,

     —СН = N— в реакциях белков с альдегидами. Эта реакция является специфичной:

       О

            II

CH —C—H+H N—Ф СН —СН=N—Ф

     Характерной особенностью азометиновых связей, является их легкое разрушение в кислых средах с регенерацией исходных веществ.

     Присоединение катализатора к носителю усложняет  описание кинетических закономерностей. Кинетика ферментативной реакции существенно  зависит от концентрации субстрата, температуры, концентрации иммобилизованных ферментов, степени измельчения частиц с иммобилизованными ферментами, скорости перемешивания, стерических ограничений, рН, полимерный носитель может оказывать ингибирующее действие или активирующее действие.

     В настоящее время широко распространена иммобилизация целых клеток или  субклеточных структур: митохондрий, хлоропластов. Такая иммобилизация имеет следующие  преимущества: сохранение природного микроокружения, что обеспечивает ферментам  повышенную стабильность, воспроизведение  ферментов природным путем. Однако кинетика иммобилизованных клеток разработана  недостаточно.

     Сохранение  стабильности ферментов является важной задачей. Инактивация ферментов может быть физической и химической. Молекулярные механизмы инактивации ферментов можно представит в виде двух стадий:

     N ,

     где N,D и I соответственно нативная, обратио денатурированная и необратимо инактивированная формы белка. Первая стадия – это чаще всего обратимое конформационное изменение. Особый интерес представляет вторая стадия (D I). Здесь действуют следующие основные условия и инактивирующие механизмы. При длительной инкубации, высокой температуре, экстремальных значениях рН, в присутствии химических денатурантов, белки агрегируют, то есть инактивация ферментов усиливается. Инактивация белков (ферментов) может сопровождаться изменением первичной структуры за счет разрыва полипептидной цепи или химической модификации отдельных функциональных групп. Кроме того, возможна рацемизация аминокислот, дезаминирование аспарагина, десорбция кофакторов из активного центра, сорбция белка на стенках реактора, инактивация в потоке и другое.

     Для иммобилизованных ферментов число  возможных инактивационных механизмов значительно меньше, чем для нативных ферментов. Так, иммобилизация подавляет агрегацию и автолиз, для иммобилизованных ферментов исключен механизм сорбции на стенках реактора, стерические ограничения вокруг фермента нивелирует действие протеаз, фосфорилаз и фосфатаз. Носитель механически защищает молекулы ферментов от деформаций в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.  
 

  
 
 
 
 
 

3. Какие известны методы определения  молекулярной массы  ДНК, их характеристики.

 

     Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК; устаревшие названия: дезоксипентозонуклеиновые кислоты, ядерные нуклеиновые кислоты, тимонукленновые кислоты, животные нуклеиновые кислоты) - нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента дезоксирибозу, а в качестве одного из пиримидиновых оснований - тимин, которым в молекулах рибонуклеиновых кислот соответствуют рибоза и урацил. ДНК представляют собой линейные полимеры дезоксирибонуклеотидов, в последовательности азотистых оснований которых закодирована вся наследственная информация.

     Таким образом, ДНК данного организма  содержит в себе информацию о всех признаках вида и особенностях индивидуума - его генотип - и передает эту информацию потомству, воспроизводя определенную последовательность оснований в строении индивидуальных ДНК. Поскольку молекулы ДНК очень больших размеров и существует огромное множество возможных неодинаковых последовательностей из четырех различных нуклеотидов, число разных молекул ДНК практически бесконечно.

     В природе ДНК содержатся во всех организмах за исключением РНК-содержащих вирусов. ДНК являются типичным компонентом  клеточного ядра, в котором они  находятся в комплексе с белками, главным образом гистонами, образуя дезоксприбонуклеопротеиды, составляющие основу цитологической структуры хроматина и вещества хромосом. ДНК обнаружена также в хлоропластах растительной клетки и в митохондриях животных и растений, в которых она кодирует часть белков этих структур, благодаря чему они обладают некоторой автономией и лишь частично зависят от ДНК ядра. 
 

     Методы  количественного  и качественного  определения.

     Большинством  цветных химических реакций ДНК  обязаны своему углеводному компоненту - дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.