Технология получения глюкоамилазы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

Тема: «Технология получения глюкоамилазы»

 

 

 

 

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Они значительно повышают скорость химической реакции, которые в отсутствии ферментов протекают очень медленно. При этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений [19].

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д. Из более чем 2000 известных в настоящие время ферментов в промышленности используется около 30 [4].

Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные продукты, в которых содержание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномасштабного получения ферментов пригодны только некоторые растительные организмы на определённой фазе их развития (проросшие зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зелёной массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных). Практически не ограниченный источник ферментов – микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящие время энзимов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

В промышленности ферментативные препараты получают либо при поверхностном, либо при глубинном способе культивирования продуцента. Глубинный способ ведения процесса имеет ряд существенных преимуществ перед поверхностным культивированием, т. к. позволяет существенно автоматизировать процесс, в ряде случаев значительно сократить объёмы отходов, проводить процесс непрерывно, сократить в 2 – 4 раза площади цехов, а также позволяет использовать анаэробных продуцентов.

Целью данной курсовой работы является разработка технологии производства препарата глюкоамилазы.

Для достижения поставленной цели должны быть выполнены следующие задачи:

1. изучение литературы, дающей информацию о применении и производстве фермента;
2. выбор микроорганизма-продуцента, подготовка его к посеву;
3. выбор метода культивирования микроорганизма, продуцирующего заданный продукт;
4. подбор оборудования и оптимального процесса его стерилизации, для проведения культивирования и выделения препарата из культур микроорганизмов;
5. выбор метода выделения, очистки и расфасовки готового препарата;
6. составление технологической схемы производства.

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Применение ферментов.

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

Большим и неоспоримым достоинством ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определённые соединения. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и расширяться.

1.2 Природа фермента, его значение в практической  деятельности человека.

Основной формой запасных углеводов в семенах и клубнях растений является крахмал. Ферментативные превращения крахмала лежат в основе многих пищевых технологий [1]. Поэтому ферменты амилолитического комплекса растительного, животного и микробного происхождения интенсивно изучаются со времени их открытия Кирхгофом в 1814 г. и до настоящего времени. Одним из таких ферментов, расщепляющих крахмал, а также гликоген, является глюкоамилаза [17].

Глюкоамилаза (α-1,4-глюкан-глюкогидролаза, амилоглюкозидаза, γ-амилаза, лизосомальная α-глюкозидаза, кислая мальтоза, матулаза, экзо-1,4-α-глюкозидаза) – экзо-фермент, катализирующий отщепление β-глюкозы от нередуцирующего конца амилозы и амилопектина [7]. Имеет больше количество гомологов, в том числе и глюкоамилаза trichoderma reese [16] Глюкоамилаза расщепляет α-1,4, α-1,6 и α-1,3-гликозидные связи, с наибольшей скоростью – α-1,4 (рис. 1). Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов, продуцирующие активную глюкоамилазу, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии. Гидролиз α-1,6-гликозидны связей происходит только в том случае, если за связью α-1,6 следует связь α-1,4, поэтому декстран ими не гидролизуется.  Механизм гидролиза - множественная атака, то есть последовательный гидролиз нескольких гликозидных связей в одной молекуле субстрата. Возможен и одноцепочечный механизм, когда фермент расщепляет все связи в одной молекуле. Отличительной особенностью глюкоамилаз является гидролиз предпочтительно высокомолекулярного субстрата. Низкомолекулярные олиго- и дисахариды расщепляются медленно.

Фермент имеет выраженную трансферазную способность, которая проявляется тем больше, чем выше степень гидролиза субстрата, и концентрация глюкозы в реакционной среде. В результате трансферазных реакций накапливаются такие сахара, как изомальтоза, паноза, нигероза, измальтотриоза и др. Появление этих продуктов снижает выход глюкозы. Поэтому в закрытой гидролитической системе, где глюкоза не удаляется из сферы реакции, теоретически невозможно достичь полного превращения крахмала в глюкозу под действием глюкоамилазы.

В открытой системе, при удалении глюкозы, снижается интенсивность трансферазных реакций, повышается скорость гидролиза за счёт снятия ингибирования продуктом реакции. В таких условиях можно достичь практически полного гидролиза крахмала до глюкозы с помощью одного фермента. На практике предпочитают использовать глюкоамилазу для осахаривания частично декстринизированного крахмала [5].

Синтезируется многими микроорганизмами, и образуется в животных тканях. Большинство глюкоамилаз – гликопротеины, содержание углеводов – от 5 до 35%, которые состоят из олиго-, моно- и дисахаридов. Углеводный компонент может быть либо целостным фрагментом, либо разбитым на индивидуальные соединения.

В промышленном биокатализе используют глюкоамилазы, продуцируемые микроскопическими грибами рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopus delamarn и Rhizopus niveus. Грибные глюкоамилазы – белки молекулярной массы от 48 до 112 кДа. Максимальная активность проявляется при рН 4,3-5,9 и температуре 40-70° С. Фермент из Asp. terreus активен в зоне рН 2-8. Глюкоамилазы мукоровых грибов способны гидролизовать крахмал на 95-100%, фермент из пенициллов и аспергиллов – на 88-95%.

Рисунок 1. Схема гидролиза α-1,4-связи в молекуле крахмала

(стрелками показано  действие фермента) [9]

 

2. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА.

2.1 Методы культивирования продуцентов фермента.

Культивирование продуцентов ферментов можно вести поверхностным и глубинным способами. Поверхностным способом можно вырастить только аэробную культуру микроорганизмов в основном на твёрдой сыпучей питательной среде.

Глубинным методом выращивают микроорганизмы в жидкой питательной среде, и этим методом можно вырастить как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Подавляющее большинство продуцентов ферментов – аэробы, поэтому при глубинном культивировании, как и при поверхностном, применяют принудительное аэрирование растущей культуры микроорганизма [14].

В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода Aspergillus - Asp. niger, Asp. oryzae, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp. batatae, в том числе рекомбинантные [23, 24, 25].

Аспергилл – это аэробные микроорганизмы, хорошо растут на различных субстратах. Образуют плоские пушистые колонии, вначале белого цвета, а затем, в зависимости от вида, они принимают разную окраску, связанную с метаболитами гриба и спороношением [6]. Аспергиллы культивируются на модифицированной среде Чапека. Так же существуют исследования, где для культивации данного микроорганизма используют отходы агросектора, то есть части сельскохозяйственных культур, которые после уборки и технической обработки не используются в качестве источника пищи или волокон [15].

Для культивировании данного продуцента в промышленности используется глубинный способ. Этот способ имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным, так как позволяет значительно сократить производственные площади, исключить тяжёлый непроизводительный ручной труд, улучшить гигиену труда, упрощает механизацию и автоматизацию производства, делает возможным переход на непрерывный способ культивирования. При глубинном способе культивирования более рационально используются питательные вещества сред, что даёт возможность значительно сократить отходы производства в виде нерастворимых осадков твёрдой питательной среды, получать препараты ферментов с меньшим содержанием примесей и большей удельной активностью [3].

Рисунок 2. Принципиальная технологическая схема процесса глубинного культивирования микроорганизмов [2]

1 – смеситель питательной  среды; 2 – колонна для непрерывной  стерилизации потока питательной  среды острым паром; 3 - теплообменник  – выдерживатель; 4 – теплообменник  для охлаждения потока питательной  среды; 5 – инокуляторы (посевные  аппараты); 6 – индивидуальный фильтр  для очистки воздуха, подаваемого  в инокулятор; 7 – реактор –  ферментер; 8,9 – насосы; 10 – масляный  фильтр для предварительной очистки  воздуха; 11 – компрессор; 12- головной  фильтр для очистки воздуха

 

2.2 Ферментёры. Стерилизация оборудования.

Глубинное культивирование проводят в вертикальных ёмкостях различного размера, называемых ферментаторами. Основное требование к ферментатору - возможность проведения процесса культивирования продуцента в асептических условиях при интенсивном аэрировании среды. В процессе культивирования приходится иметь дело со сложной трёхфазной системой жидкость - твёрдая взвесь - газ. В такой системе затруднены массообменные процессы, и в связи с этим усложняется аппаратурное оформление всей стадии выращивания.

Существующие промышленные ферментаторы по способу подвода энергии на аэрирование и перемешивание можно подразделить на три группы: аппараты с механическим перемешиванием и барботажем (комбинированные) (рис. 3); с эжекционной системой аэрирования (подвод энергии к жидкой фазе) и барботажные (подвод энергии к газовой фазе). Для ферментной промышленности самый значительный интерес представляет первая группа аппаратов, предназначенная для асептических процессов. Эти аппараты в основном имеют цилиндрическую форму и отличаются по объёму, конструкции отбойников, перемешивающих устройств, уплотнений вращающегося вала и теплообменным устройствам [8].

Рисунок 3. Ферментатор барботажного типа с перемешивающим устройством объёмом 100 м3 [3].