Технология получения глюкоамилазы

Экстракт с содержанием сухого вещества 7 – 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные ёмкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может храниться и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д. Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 – 40 °С (рис. 4). Кроме того, повышение температуры до 35 – 40 °С влечёт за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путём максимального снижения температуры воды до 22 – 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 – 7 [3].

Экстракты из фильтратов глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратов используются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями. В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 – 20 %, изменяется рН концентрата. В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака [2].

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удаётся (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют [20].

Процессу микрокапсулирования, т.е. заключению ферментных препаратов в полупроницаемую оболочку-капсулу, уделяется большое внимание. Микрокапсулирование имеет целью не только защиту фермента, но и создание возможности его многократного использования, а также вывода его из процесса в случае, если его дальнейшее пребывание в обрабатываемом субстрате нежелательно. Для микрокапсулирования применяют полимеры животного происхождения: казеин, желатин, альбумин. С большим успехом на практике применяются синтетические полимеры: поливинилацетат, полиакриламид, поливиниловый спирт и т.п. Сам процесс микрокапсулирования может быть осуществлён двумя способами: химическим или физическим. К химическим следует отнести способ образования плёнки на границе раздела двух фаз при реакциях полимеризации и поликонденсации. К физическим методам можно отнести вакуум-напыление, микрокапсулирование в псевдоожиженном слое, при взаимодействии аэрозолей, имеющих различный электрический заряд [12].

Более широко, чем микрокапсулирование, используется метод гранулирования ферментных препаратов. Гранулирование обычно связано с необходимостью ликвидировать пыление ферментного препарата. Гранулы ферментных препаратов можно получить различными способами: окатыванием, прессованием, таблетированием, в виброкипящем слое и т.д. [3].

Очень часто ферментативная активность партии готового препарата заметно отличается от предыдущих. Потребитель же должен получать препарат с определённой стандартной активностью. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определённом количестве, которое зависит от полученной на данном предприятии активности в культуре и препарате. Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов является крахмал [3, 18]. Так же существуют исследования, где в качестве стабилизатора применяется коллаген [11].

 

3. РАСЧЁТ МАТЕРИАЛЬНОГО БАЛАНСА.

Исходные данные [18]:

1) Производительность цеха – 5тыс. усл. т/год Глюкавоморина

2) Число рабочих дней  в году – 345

3) Продуктивность культуры  – 250 ед/мл

4) Объем ферментатора  – 100 м3

5) Продолжительность ферментации  – 5-6 суток (130 ч)

6) Оборот ферментатора  – 142 ч

7) Коэффициент заполнения  ферментатора – 0,7

8) Объем основной питательной  среды – 70 м3

9) Основной состав среды, кг/м3:

• кукурузная мука – 300
• ячменный солод для разжижения мучного замеса – 1.5
• ячменный солод для осахаривания – 7.5
• гидрофосфат аммония – 4.5
• пропинол Б-400 – 0.58
• рН – 3.0-4.8
• посевной материал – 7 м3 (5-10% от объема основной ПС)

10) Состав посевной питательной  среды

• кукурузная мука – 5.0
• кукурузный экстракт – 1.0
• вода – остальное
• рН – 4.8-5.0

11). Испарение и каплеунос  при ферментации – 8% от объёма культуральной жидкости

Предварительный расчёт:

• Объем производства составляет 5 000 усл. т/год или

12000/345=34,783*103 (усл. кг/сут.)

*250 ед/мл=8695,7*103 (кг/сут*ед/мл)

• Количество Глюкаваморина в культуральной жидкости с одной операции

8695,7*103 (кг/сут*ед/мл) / 1050 (кг/м3) = 8,282*103 (м3/сут*ед/мл),

где 1050 (кг/м3) – плотность Глюкаваморина

 

• Для приготовления производственной питательной среды объёмом 70 м3 требуется:

1) кукурузная мука

70*300=21000 кг

21000/1360=15.44 м3, где 1360 кг/м3 плотность кукурузной муки

2) ячменный солод для разжижения

1.5*70=105 кг

105/1050=0.1 м3, где 1220 кг/м3 плотность ячменного солода

3) солод для осахаривания

7.5*70=525 кг

525/1050=0.5 м3

4) NH4H2PO4 4.5*70=315 кг

315/1830= 0.175 м3

где 1830 кг/м3 плотность NH4H2PO4

5) Пропинол Б-400

0.58*70=40.6 кг

40.6/990=0.041 м3, где 990 кг/м3 плотность пропинола Б-400

Общий объем всех компонентов с учётом посевного материала:

7.0+15.44+0.1+0.5+0.175+0.041=23.256 м3

Таблица 1. Материальный баланс производства Глюкаваморина.

ПРИХОД
Наименование компонентов	На 1 операцию		В сутки
	По m, кг	По V, м3	По m, кг	По V, м3
Кукурузная мука	21000	15.44	42000	30.44
Ячменный солод для разжижения	105	0.1	210	0.2
Солод для осахаривания	525	0.5	1050	1
NH4H2PO4	315	0.175	630	0.35
Пропинол Б-400	40.6	0.041	81.2	0.082
вода	46744	46.744	93928	93.928
Посевной материал	7151.2	7.0	14302.4	14
ИТОГО	75880.8	70	152201.6	140
РАСХОД
Жидкость на каплеунос и испарение	6070.464	5.6	12176.128	11.2
КЖ	69810.336	64.4	140025.472	128.8
ИТОГО	75880.8	70	152201.6	140

 

• Для приготовления питательной среды объёмом 7 м3 требуется:

Масса раствора: 1021.6*7=7151.2 кг, где 1021.6 кг/ м3 средняя плотность среды.

1) кукурузной муки

7151.2*0.05 = 357.5 кг 

2) кукурузного экстракта

7151.2*0.01= 71.51 кг 

3) воды

7151.2*0,94 =6722.128 кг

Таблица 2. Материальный баланс получения посевного материала

ПРИХОД
Наименование компонентов	На 1 операцию		В сутки
	По m, кг	По V, м3	По m, кг	По V, м3
Кукурузная мука	357.56	0.259	715.12	0.158
Кукурузный экстракт	71.512	0.057	143.024	0.114
Вода	6722.128	6.72	13444.256	13.44
ИТОГО	7151.2	7.036	14302.4	14.072
РАСХОД
На каплеунос	572.1	0.563	1144.2	1.126
КЖ	6579	6.44	13158	12.88
ИТОГО	7151.2	7.003	14302.2	14.06

 

 

 

4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВИЙ ТРУДА РАБОТАЮЩИХ НА ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТОВ.

4.1 Микробиологический контроль производства.

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведётся контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивирования устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма [3,18].

Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах даётся разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.

4.2 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты.

Инженерные мероприятия являются наиболее важными. Они призваны максимально предотвратить выход и вынос ферментных препаратов в помещения и за пределы предприятия, т. е. исключить контакт с ними человека. Известно также, что в производстве помимо самих ферментных препаратов используется ряд веществ, обладающих токсическими свойствами. Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и даже профессиональные заболевания.

Рисунок 9. Мероприятия, обеспечивающие безопасность труда и защиту окружающей среды [3].

Основными мерами профилактики в производстве ферментных препаратов являются: максимальная герметизация оборудования и механизация процессов; применение индивидуальных средств защиты (комбинезоны, шлемы-капюшоны, халаты, перчатки, косынки, респираторы); ежедневный тёплый душ после работы, обеспыливание, стерилизация рабочей одежды; мытье рук и полоскание рта перед приёмом пищи; ежегодные медицинские осмотры; приём во время работы молочного колибактерина или молока. К работе на предприятиях ферментной промышленности нельзя допускать лиц с заболеваниями почек, печени, желудочно-кишечного тракта, лёгких, а также склонных к кожным болезням.

Уменьшение запылённости заводских помещений достигается путём герметизации оборудования. Если это невозможно по местным условиям, то устанавливают устройства с индивидуальной аспирацией данного узла. Операции, связанные с пылевыделением, необходимо изолировать от других помещений, по возможности механизировать и автоматизировать.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов опасность поражения работающих спорами продуцента уменьшается, сокращается число технологических участков, являющихся источником пыли. Тщательного контроля в производствах с этим видом культивирования требуют цех приготовления питательных сред, операции по транспортированию и хранению сыпучих компонентов среды, а также цех получения и измельчения ферментных препаратов.

Особенно большое внимание уделяется на предприятиях, выпускающих ферментные препараты и другие продукты микробного синтеза, вопросам очистки воздуха, используемого для аэрирования растущей культуры перед его выбросом в атмосферу. Повышенная обсеменённость отходящего воздуха может вызвать накопление в атмосфере, прилежащей к заводу, микроорганизмов-продуцентов, что недопустимо. Поэтому весь отходящий воздух должен тщательно очищаться и контролироваться на количество микроорганизмов и их видовой состав. Удаляемый из помещений воздух, загрязнённый микроорганизмами, очищают на масляных и обеспложивающих фильтрах.