Технология получения глюкоамилазы

1 – привод; 2 – корпус; 3 – муфта; 4 – барботёр; 5 – крыльчатка; 6 – змеевик; 7 – турбина; 8 – вал; 9 – труба для вывод жидкости  из ферментатора под высоким  давлением.

 

Аппараты рассчитаны для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при температуре 130 - 140 °С. Во избежание инфицирования культуры предусмотрены торцовые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцовые уплотнения позволяют практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте выхода из него вала, что очень важно для обеспечения асептических условий процесса. Важным фактором с точки зрения асептики процесса культивирования продуцента является правильная обвязка ферментатора. Под обвязкой подразумевают подвод всех коммуникаций с учётом возможности стерилизации острым паром участков, которые могут явиться источником заражения.

Характерной особенностью одной из самых распространённых в микробиологическом производстве монтажных схем является установление термических затворов 3 и 5 (рис. 4) для предупреждения проникновения посторонней микрофлоры в аппарат по коммуникациям через неплотности в уплотнениях «седло - клапан» запорной арматуры. Такие термические затворы обеспечивают весьма эффективную защиту аппаратов и коммуникаций от инфицирования. В монтажных схемах должен предусматриваться свободный доступ пара во все точки стерилизуемых внутренних полостей аппаратов, трубопроводов и запорной арматуры, что обеспечивает достижение и поддержание требуемой температуры стерилизации. Однако на практике часто одно и то же монтажное оформление коммуникаций и запорной арматуры различного диаметра не обеспечивает равного стерилизующего эффекта.

Следует также уделять большое внимание процессу пенообразования при культивировании и устройствам для пеногашения. Все существующие и используемые в ферментной промышленности ферментаторы снабжены специальными устройствами для введения пеногасителя и контроля высоты пены в аппарате. Схема пеногашения, принятая в стерильных производствах, представлена на рисунке 5. В неё включены датчики 1, 2 и 3 различных уровней пены.

Стерилизации аппаратов и коммуникаций уделяют огромное внимание. Аппаратуру и коммуникации стерилизуют острым паром при температуре 130–140оС и избыточном давлении 0,15–0,2 МПа. Самая тщательная стерилизация может не дать эффекта, если нарушена герметичность оборудования. Все вентили перед установкой проверяют гидравлическим опрессовыванием при давлении 0,3 МПа, герметичность соединений проверяют при избыточном давлении пара 0,15–0,2 МПа. Особое внимание уделяется стерилизации аппаратуры и подачи пеногасителя. Стерилизацию этих узлов проводят при 135–140оС в течении 1,5–2 ч. На стадии стерилизации ведётся постоянный микробиологический контроль стерильности питательной среды, подаваемого в стерилизатор воздуха, пеногасителя и т.д.

Рисунок 4. Монтажная схема ферментатора с нижним спуском среды [3].

1 – штутцер для введения  посевного материала; 2 – провод  для удаления отработавшего технологического  воздуха; 3, 5 – термические затворы; 4 – пробник.

 

Рисунок 5. Схема автоматизации пеногашения [3].

1, 2, 3 – датчики уровня  пены; У1, У2, У3 – усилители электросигнала; РВ1, РВ2 – реле времени; СК1, СК2 –  электромагнитные клапаны; МП –  магнитный пускатель; М – электродвигатель  мешалки.

2.3 Приготовление и стерилизация питательных сред

Аспергиллы, продуценты глюкоамилазы, являются типичными аэробами, поэтому они могут развиваться только на поверхности твёрдой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для, большинства аспергиллов 25—30°С, для некоторых — до 35°С. Оптимальная влажность среды для них около 65%.

При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объёме жидкой питательной среды. Так как представленный продуцент фермента — строгий аэроб, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два неразрывно связанных процесса — синтез биомассы и синтез ферментов.

Для максимального накопления ферментов необходимы определённый состав питательной среды, обеспечение кислородом воздуха, своевременный отвод метаболитов и физиологического тепла, оптимальные значения рН и температуры. Важнейшим условием является также стерильность питательной среды, подаваемого воздуха, ферментаторов, трубопроводов и арматуры.

Для глубинного культивирования используют жидкие питательные среды, содержащие примесь твёрдых компонентов. В комплексных питательных средах, основанных на естественном сырье с добавлением отрубей, ростков, кукурузного жмыха, глютена, свекловичного жома, спиртовой барды, следят за тем, чтобы не было крупных комочков, так как они затрудняют стерилизацию и могут привести к забиванию коммуникаций. Поэтому перед смешением необходимо проводить просеивание твёрдых компонентов или грубую фильтрацию.

Жидкую часть питательной среды (вода или фильтрат барды) обогащают питательными слоями, гидролизатами белков, аминокислотами, источниками биоса, различными углеводами. Содержание сухих веществ в жидких питательных средах может колебаться от 1,5 до 16% в зависимости от рода продуцента и принятого режима культивирования [18].

Для образования амилолитических ферментов плесневелыми грибами в условиях глубинного выращивания предложены также различные питательные среды, представляющие собой видоизменённые среды Чапека. Для повышения активности ферментов предложена среда, содержащая 6% крахмала, азотнокислый натрий, солевой состав среды Чапека и водную вытяжку из солодовых ростков. В дальнейшем исследователями установлена возможность замены растворимого крахмала кукурузной или ржаной мукой.

Для глубинного культивирования Asp. awamori (наиболее активного по глюкоамилазной способности из имеющихся штаммов) рекомендуется следующий состав питательной среды: водный раствор, содержащий 3% кукурузной муки; 0,01% азотнокислого натрия (по азоту 0,15%); 0,05% сернокислого магния; 0,05% хлористого калия; 0,1% однозамещённого фосфорнокислого натрия и 0,001% сернокислого железа [2].

Стерилизацию питательных сред можно провести двумя способами: периодическим и непрерывным. Периодический способ используется при работе с небольшими объёмами в лабораторных условиях. Он довольно длителен и происходит при меньших температурах, чем непрерывный. Непрерывный метод стерилизации используется для больших объёмов. Происходит при температуре 140 – 145оС и выдерживается 1–10 минут. Предложено несколько конструкций непрерывных стерилизаторов. Общим для всех аппаратов этого типа является расчленение процесса на три этапа и проведение каждого из них в потоке в отдельном аппарате. Первый аппарат, в котором среда нагревается до температуры стерилизации, называется стерилизатором, нагревательной колонкой или колонкой для стерилизации питательной среды (рис. 6, а). Второй аппарат, где стерилизуемую массу выдерживают при определённой температуре стерилизации, называется выдерживаетелем. Он предназначен для продления времени стерилизации и достижения максимальной гибели микрофлоры (рис. 6, б, в). Третий аппарат – теплообменник, предназначенный для охлаждения стерильной питательной среды до оптимальной температуры засева [3].

2.4 Подготовка посевного материала.

Для засева производственной питательной среды при глубинном культивировании посевной материал готовят также глубинным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента. Для грибов — это мицелиальная масса.

Получение посевного материала осуществляется постадийным увеличением массы культуры продуцента. При небольшой производительности цеха она сводится к одной или двум операциям, а для заводов большой производительности представляет собой многостадийный процесс [10].

Рисунок 6. Аппараты непрерывной стерилизации жидкой питательной среды [3]:

а – тарельчатые нагревательные колонки; б – выдерживатель колонного типа; в – выдерживатель спирального типа.

 

Для Аsp. awamori:

1. Пробирка с исходной  культурой на агаризованной питательной  среде;

2. Пересев водной суспензии  культуры в колбы с жидкой  питательной средой, содержащей 5% кукурузной  муки и 0,5% дрожжевого автолизата, культивирование на качалке в  течение 48 ч;

3. Пересев культуры в  сосуды вместимостью 6л (величина  засева 10-12% к объёму питательной  среды), культивирование 48 часов;

4. Пересев культуры в  инокулятор на кукурузное сусло  концентрацией 6%, культивирование в  течение 48 ч при температуре 27°С, перемешивании мешалкой с частотой  вращения 950 об/мин и подачей воздуха 16 м3/ч;

5. Пересев культуры в  производственный ферментатор (величина  засева 3 – 5% к объёму питательной среды).

Культивирование на всех стадиях должно проводиться при оптимальной температуре, аэрации и в строго определённое время. Если возникают непредвиденные задержки в использовании, то по­севной материал охлаждают до 8 - 10°С и хранят не дольше 4 ч, иначе качество его может резко ухудшиться.

Посевной материал как на отдельных стадиях, так и готовый подвергают тщательному микробиологическому контролю. Посевной материал не должен быть инфицирован посторонней микрофлорой и должен содержать определённое количество спор или клеток на единицу массы, стойко сохранять генетически заложенные в нем свойства продуцировать ферменты [18].

2.5 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение, очистка и расфасовка препарата фермента.

Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов – трудоёмкий и дорогостоящий процесс поэтому, если ферментный препарат можно использовать в виде неочищенной культуры микроорганизмов, его очистку не проводят.  В большинстве отраслей пищевой промышленности, а также в текстильной, меховой, микробиологической промышленности и особенно медицине можно использовать только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобождённые от балластных веществ.

Исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов может служить фильтрат культуральной жидкости, реже – биомасса продуцента или водный экстракт из поверхностной культуры продуцента. Ферментные препараты могут быть получены в виде порошков или жидких концентратов. В процессе выделения происходит повышение доли активного белка в общей массе препарата, т. е. увеличивается его удельная активность.

Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы (рис. 7).

Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, применённых для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, и препаратов, осаждённых органическими растворителями (рис. 8).

Рисунок 7. Схема выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов [2].

Фильтрат охлаждённой культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передаётся в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки плёночного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 – 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого технического препарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.

Рисунок 8. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных глубинным и поверхностным способами [3].

1 – сборник фильтрата  культуральной жидкости; 2 – подогреватель  вакуум-выпарной установки; 3 – сборник  экстракта поверхностной культуры; 4 – конденсатор; 5 – сборник конденсата; 6 – вакуум-выпарной аппарат; 7 –  сборник концентрата; 8 – распылительная  сушилка; 9 – теплообменники; 10 –  циклон; 11 – бункер для высушенного  препарата; 12 – шнек; 13 – фильтр  рукавный; 14 – осадитель; 15 – дозаторы; 16 – сепаратор; 17 – насос для  спирта; 18 – мерник для спирта; 19 – смеситель промывки осадка спиртом: 20 – центрифуга; 21 – вакуум-сушилка роторная; 22 – бункер для высушенного осадка; 23 . 25 – бункера для наполнителей; 24 – бункер для сухого препарата; 26 – установки дисмембраторов; 27, 28 – весы; 29 – смесители непрерывного действия; 30 – бункера для стандартизированного препарата; 31 – установки для фасования и упаковывания препаратов; 32 – установка для экстракции ферментов; 33 – сушилка для биошрота; 34 – резервуар для воды; 35 – стерилизационная установка для сточных вод; 36 – охлаждающий теплообменник; 37 – фасование и упаковывание жидкого препарата Г2х или П2х.

Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подаётся на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 – 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлаждённый растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 16. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок – на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.

При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.