Санитарно-бактериологическое исследование продуктов питания

бактериологический исследование пищевой продукт

8. Определение количества бактерий группы кишечных палочек методом наиболее вероятного числа - НВЧ (COLIFORMES - ФАО/ВОЗ И СЭВ)

Группа колиформных бактерий включает все аэробные и факультативно анаэробные грамотрицательные неспорообразующие палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа в течение 24 - 48 часов при 36 град. C +/- 1 град. C, относящиеся к E. coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Seratia. В связи с тем, что принято определять БГКП по ферментации лактозы при 36 град. C +/- 1 град. C в течение 24 - 48 часов, то группы микроорганизмов, относящиеся к "колиформным бактериям" и БГКП, в максимально сближены и по существу являются идентичными. Поэтому метод определения НВЧ для колиформных бактерий отражает и определение наиболее вероятного числа БГКП в исследуемом объеме продукта.

Ход исследования. Гомогенат или жидкий продукт, разведенный 1:10, набирают в пипетку в количестве 1,0 мл и переносят в пробирку, содержащую 9 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 10 раз, получая т.о. разведение продукта 1:100. Затем готовят разведения 1:1000, перенося каждый раз стерильной пипеткой 1 мл из приготовленного разведения в следующую пробирку с 9 мл 0,1% пептонной воды. Осторожно встряхивают все разведения. Вносят по 1 мл разведения продукта 1:10 в 3 пробирки с 10 мл среды КОДА. Таким же образом производят посев двух последующих разведений 1:100 и 1:1000, используя для этих целей каждый раз чистую стерильную пипетку. Посевы инкубируют при 36 град. C +/- 1 град. C в течение 24 часов. Регистрируют все пробирки, показавшие образование газа или изменение цвета среды через 24 часа. Пробирки без признаков роста инкубируют еще 24 часа и затем регистрируют те пробирки, где есть признаки роста. Затем проводят тест, подтверждающий наличие БГКП в исследуемом продукте, для чего переносят одну полную петлю из каждой положительной пробирки со средой КОДА в отдельные пробирки с желчно-лактозным бульоном, содержащим бриллиантовую зелень - средой ЖЛБ, и инкубируют эти пробирки при 37 град. C в течение 24 - 48 часов. По образованию газа в поплавках регистрируют число положительных пробирок, которые подтверждают наличие БГКП.

Расчет наиболее вероятного числа (НВЧ) БГКП.

Наиболее вероятное число БГКП рассчитывается в зависимости от количества пробирок с положительной пробой на газообразование в ЖЛБ по таблице 1. Например, положительное газообразование отмечено в 3-х пробирках посева разведения 1:10, в 1 пробирке посева разведения 1:100 и 0 пробирок из разведения 1:1000. Из таблицы видно, что НВЧ для такой комбинации положительных реакций равно 43 бактериям в 1 г продукта. В заключении указывают: "1 г или 1 мл продукта содержит 43 БГКП".

9. Определение e. coli по методу НВЧ

При необходимости определения наличия E. coli в исследуемом на БГКП продукте по методу НВЧ одновременно с подтверждающим пересевом на ЖЛБ с бриллиантовой зеленью может быть сделан пересев из всех пробирок с наличием признаков роста на среде КОДА на среду Кесслер с лактозой или на среду для E. coli (п. 6.7) - EC-бульон. Засеянные пробирки инкубируют при 44 град. C +/- 1 град. C 24 часа и регистрируют образование газа. Для дифференциации выделенных культур применяют реакции на индол, метил-рот, Фогэс-Проскауэр и цитрат. Из пробирок с положительной реакцией (образование газа) штрихом производят посев на чашку с агаром Левина таким образом, чтобы получить изолированные колонии, и инкубируют 18 - 24 часа при 37 град. C. Переносят 2 - 3 колонии с каждого выросшего посева на среде Левина на чашку или пробирку с 2% МПА и инкубируют 18 - 24 часа при 37 град. C. В то же время из каждой культуры готовят мазки и производят окраску по Граму.

Постановка тестов ИМАЦ

Тест на индол. Культуру со скошенного агара инокулируют в пробирку с 5 мл индольной среды и инкубируют при 37 град. C в течение 24 часов. Добавляют 1 мл индольного реактива. При наличии индола в пограничном слое в течение 5 мин. появляется красное окрашивание - положительная реакция.

Реакция Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

Культуру со скошенного агара петлей вносят в пробирку с 5 мл среды Кларка. Посев инкубируют при 37 град. C в течение 48 часов. Затем к 1 мл культуры, перенесенному в другую пробирку, добавляют 0,6 мл этанолнафтольного реактива и 0,2 мл раствора КОН. Встряхивают после добавления каждого реактива, читают реакцию через 15 минут. Учет результатов возможен и через 2 часа. Окраска от розовой до ярко-красной показывает, что реакция на образование ацетилметилкарбинола положительная.

Тест на метил-рот. Инокулируют пробирку со средой Кларка и инкубируют в течение 48 часов при 36 град. C +/- 1 град. C (параллельно с постановкой реакции на ацетилметилкарбинол), в оставшиеся после постановки реакции Фогеса-Проскауэра 4 мл культуры добавляют 4 - 5 капель индикатора метил-рот в каждую пробирку. Реакция ферментации углеводов с образованием кислоты положительная, если появилось красное окрашивание.

Тест с утилизацией цитрата. Культуру с МПА пересевают в пробирку со средой Козера (цитратной) или на чашку со средой Симмонса, инкубируют 96 часов при 37 град. C и проверяют рост. Отсутствие роста и изменения цвета среды - реакция отрицательная. Наличие роста, изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый свидетельствует об утилизации цитрата - реакция положительная.

10. Метод определения бактерий рода PROTEUS

Среди этимологических факторов пищевых токсикоинфекций существенную роль могут играть бактерии рода Proteus. Обнаружение небольших количеств протея в исследуемых продуктах не является поводом для подозрения его как возбудителя пищевого отравления.

Однако факт обнаружения протея является сигналом для проведения ряда санитарно-гигиенических и профилактических мероприятий на обследуемых объектах. К роду Proteus относятся грамотрицательные бескапсульные, в основном, подвижные бактерии, разжижающие желатину и расщепляющие мочевину, не образующие ацетилметилкарбинол и дающие положительную реакцию с метил-рот. На основании различий по некоторым ферментативным свойствам возможна дифференциация рода Proteus на две биогруппы: Proteus vulgaris, который образует индол, ферментирует мальтозу и не декарбоксилирует орнитин, и Proteus mirabilis, который не образует индола, не ферментирует мальтозу и декарбоксилирует орнитин.

Методика выделения бактерий рода Proteus

1 день. а) Для получения чистой  культуры первичный посев исследуемого  материала из основного разведения (10% взвесь) производят по 0,5 мл в  конденсат свежескошенного агара  по методу Шукевича. На 2-й день  просматривают посевы на скошенном  МПА, если наблюдается вползающий  нежный рост вуалеобразный рост, то с верхнего края выросшей  культуры готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных полиформных палочек дают заключение о наличии бактерий рода Proteus в исследуемом продукте. Кроме того, можно использовать посев на поверхность питательной среды Плоскирева или среды Вильсон-Блера, который производят в количествах 0,5 мл исходной взвеси, тщательно втирая шпателем, инкубируют при 37 град. C 18 - 24 часа. На поверхности сред Плоскирева или Вильсон-Блера вырастает O-форма протея. Для получения из O-форм колоний H-форм одну петлю суточной бульонной культуры протея наносят на поверхность свежеприготовленного 1,5% МПА в центре чашки. Через 16 - 18 часов инкубирования при 37 град. C наблюдается феномен "роения" - поверхность покрывается тонким слоем налета с голубоватым оттенком. После инкубации в течение 18 - 24 часов при 37 град. C чашки с посевами просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему исследованию. На среде Плоскирева штаммы растут в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивая среду, которая окрашивается вокруг них в желтоватый цвет. При более длительном хранении чашек с посевами колонии мутнеют, а центр их приобретает бурую окраску. На висмут-сульфитном агаре (среда Вильсон-Блера) через 48 часов штаммы вырастают в виде изолированных колоний грязно-коричневого цвета, окраска среды под колониями не изменяется. Если рост 18 - 24 часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее 3-х колоний. При рост разных колоний для их изучения надо брать больше колоний, различных по внешнему виду.

При наличии характерной микроскопической картины дают заключение о присутствии бактерий рода Proteus в исследуемом продукте Идентификацию бактерий рода Proteus проводят в случае

эпидситуации на объекте в соответствии с Инструкцией о порядке

расследования, учета и проведения лабораторных исследований в

учреждениях санэпидслужбы при пищевых отравлениях, Москва, 1975.. Случайные находки бактерий рода Proteus при определении бактерий группы кишечных палочек необходимо отражать в ответе.

11. Определение сальмонелл

В соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ в большинстве пищевых продуктов нормируется отсутствие сальмонелл в определенной массе продукта. Сальмонеллы признаны индикаторными микроорганизмами при контроле пищевых продуктов на возможное присутствие патогенных микроорганизмов. В особо скоропортящейся продукции общественного питания сальмонеллы не допускаются в 25 г. Анализ проводят в соответствии с Инструкцией о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, Москва, 1975.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1. Методические рекомендации для  микробиологов. - М., 2005.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская  микробиология, иммунология и вирусология. - СПб, 2008.

3. Борисов М.Р. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. - СПб, 2006.

4. Попова А.С. Экологическая биохимия  питания. - М., 2006.

5. Мартинчик А.Н. Физиология питания, санитария и гигиена. - М., 2008.

6. Королев А.А. Гигиена питания. - М., 2006.