Гибридизация in situ fish. Биочип

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего     профессионального  образования

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ  МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

Кафедра биологии

 

 

Реферат на тему:

 

 «ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU FISH. БИОЧИП»

 

 

 

 

Докладчик:

Студент 2 курса

 педиатрического факультета 

Саматова Эльвира Тахировна

Группы 2205

 

 

 

 

2013 г.

ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU FISH

 

Флюоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. Fluorescence in situ hybridization - FISH) — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

FISH сочетает в себе преимущества  классических цитологических, цитогенетических  и новейших молекулярных методов.  Подобно классическим методам  в гистологии, цитологии и цитогенетике, FISH может проводиться на тканевых, клеточных и хромосомных препаратах. Однако объектом исследования  в данном случае являются не  морфологические особенности ткани,  клеток или хромосом, а уникальные  нуклеотидные последовательности  конкретной хромосомы или ее  отдельного участка. Соответственно, выявляемые изменения являются  генетическими (этиопатогенетическими), а не морфологическими (фенотипическими), и относятся к более тонкому уровню организации наследственного материала клетки.  

 

 

     Подобно цитологическим  и классическим цитогенетическим  методам, FISH метод позволяет оценить  генетический статус отдельной  клетки и выявить, к примеру,  несколько этиопатогенетически значимых аномальных клеток среди тысяч других с нормальным генотипом. Такое не под силу ни одному методу, даже такому распространенному молекулярному методу как ПЦР, при котором ДНК всех клеток смешивается и результат усредняется.  

 

 

     В описываемом  методе используются короткие последовательности ДНК, называемые зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода. 

FISH может применяться  для различных целей с использованием  зондов трех различных типов: 

 

• локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом,
• альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа,
• зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

 

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии.

 

ЗОНДЫ

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флюоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3—4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР-реакции, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции.

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

 

ЭТАПЫ ГИБРИДИЗАЦИИ

На первом этапе происходит конструирование  зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.

Далее к препарату добавляют  зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько  стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного  микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя. 

 Однако, флуоресцентная гибридизация in situ имеет один существенный недостаток. Зонды являются специфичными только к одному участку генома и, как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или число копий только этого участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов). Поэтому важным является правильная клиническя предпосылка, а FISH анализ может только подтвердить иди не подтвердить диагноз. В последнем случае анализ призодится повторять в отношении сходных синдромов и это далеко не всегда приносит желаемый результат. Альтернативой этому методу является хромосомный микроматричный анализ, который при такой же точности, чувствительности и специфичности определяет количество генетического материала в сотнях тысяч (и даже миллионах) точек генома, что дает возможность диагностики пактически всех известных микроделеционных и микродупликационных сииндромов.

 

БИОЧИП

Биочип (биологический микрочип, англ. biochip) — микромножество либо матрица с нанесёнными молекулами белков, нуклеиновых кислот, биомакромолекул или биоструктур для одновременного проведения большого числа анализов в одном образце; или электронное устройство, содержащее биологические молекулы.

Биологические микрочипы  широко используются в in vitro диагностике. В основе механизма действия биочипов лежит молекулярное распознавание анализируемых молекул молекулами биополимерами, нанесёнными на чип. Это распознавание построено либо на взаимодействии рецепторов с лигандами (например, антител с антигенами), либо на гибридизации комплементарных цепей ДНК. В частности, разработаны биочипы, распознающие короткие олигонуклеотидные последовательности и позволяющие детектировать единичные мутации в генах. Наноразмерная длина олигонуклеотидов, нанесённых на микрочип, является одним из ключевых факторов, определяющих их высокую эффективность и специфичность.

На поверхности ДНК-чипа иммобилизованы олигонуклеотиды. При добавлении анализируемого образца комплементарная таргетная ДНК в образце формирует дуплекс с олигонуклеотидом на чипе. В результате генерируется сигнал, свидетельствующий о наличии в пробе соответствующего объекта (инфекции, онкомаркера и т. п.).

 

 

 

 

 

 

Литература:

• Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие. — Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т., 2006. — 152 с. 
• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий. Глава в книге // Введение в молекулярную диагностику / Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. — М.: Медицина, 2011. — Т. 2 (Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний). — С. 100-136. — 1000 экз. 
• http://www.genomed.ru/fish/
• Osipova T., Sokolova Z., Ryabykh T. et al. Biochip-based test-system for cancer diagnostics. Simultaneous quantitation of total and free forms of prostate-specific antigene // Nanotechnology. CRC Press. Boston. V. 1–3, 2008. P. 30–33.