Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мя

Ниже представлены схемы  конструирования штаммов с заданными  свойствами: «Схема получения суперэкспрессии гена Y» и «Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y».

Для получения суперэкспрессии  нужного гена Y между этим геном и участком хромосомы вводится конструкция, состоящая из двух элементов – гена тимидилат синтетазы thyA и сильного промотора, например, гена ксилозоизомеразы xylA. Введение дополнительных элементов в хромосому осуществляется с помощью термочувствительной плазмиды pBT2 (Bruckner R., 1993), несущей конструкцию для интеграции. Конструкцию для интеграции синтезируют с использованием ПЦР и клонируют в плазмиде pBT2 с образованием плазмиды pInt. Далее модифицируемый штамм трансформируют плазмидой pInt и проводят селекцию на среде GS без тимидина с хлорамфениколом, т.е. отбираются штаммы, в которых прошла трансформация. После этого плазмиду удаляют с помощью теплового шока, а штамм проверяют на способность расти на среде GS с тимидином и на чувствительность к хлорамфениколу. Таким образом, мутантный штамм приобретает ген thyA и способность расти на среде GS без тимидина, а ген Y оказывается под контролем сильного регулирующего промотора, например, промотора гена xylA.

Выключение гена проводится подобным образом, за исключением того, что с помощью ПЦР синтезируют  и клонируют в pBT2 фрагмент, содержащий левый и правый фланги выключаемого гена, между которыми встроен маркер thyA.

 

Определение генетических детерминантов декарбоксилаз  аминокислот

Любое свойство, проявляемое  микроорганизмом, является следствием активности определенного гена или  группы генов, входящих в геном этого  штамма. Определение генов, ответственных за проявление того или иного технологического свойства, является отдельным этапом в конструировании промышленно-ценных микроорганизмов.

Методом ПЦР у тирамин-позитивных штаммов L. sakei 101, 103, 105 были найдены tdc гены (рис. 12), кодирующие тирозиндекарбоксилазную активность. На картине электрофореза показаны tdc гены штаммов L. sakei 101, 103, 105 при разных температурах отжига праймеров. Размер tdc гена для этих штаммов составляет 1866 п.н. (Национальный центр биотехнологической информации, NCBI, США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В связи с тем, что выбранные универсальные праймеры для всего вида L. sakei не захватывают всю рамку считывания, для L. sakei 101, 103, 105 были получены фрагменты размером 846 п.н. (крайние точки отжига – 1193 и 347 п.н.).

                                     

Рис. 12. Картина  электрофореза тирозиндекарбоксилазных  генов tdc у тирамин-позитивных штаммов Lactobacillus sakei 101, 103, 105

Обозначения: М – маркер GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, 1 – L. sakei 101, 2 – L. sakei 103, 3 –                   L. sakei 105 при температурах отжига 48, 50 и 52 °C

Создание методами генной инженерии штаммов с выключенной  декарбоксилазной активностью (см. Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y) позволит получать промышленно-ценные микроорганизмы с оптимальными технологическими параметрами, но не способные продуцировать биогенные амины и, тем самым, безопасные для здоровья потребителя.

Генетика  продуцирования бактериоцинов

 

Синтез бактериоцинов  с высокой киллерной активностью  и широким спектром ингибирования  микроорганизмов порчи был обнаружен  у видов P. pentosaceus и                        P. acidilactici (Ped⁺ штаммы). В большинстве случаев локализация генов, кодирующих синтез педиоцинов, является плазмидной. В связи с этим у Ped⁺ штаммов получены данные по плазмидному профилю, и определены размеры плазмид (рис. 13). У штаммов P. acidilactici 27 и P. acidilactici 38 было найдено по одной плазмиде размером примерно 11 т.п.н., у штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55 плазмид обнаружено не было. По размеру плазмиды, найденные у бактериоцин-синтезирующих штаммов P. acidilactici 27 и 38, являются крупными, и, как показал анализ литературных источников, именно на таких плазмидах локализованы гены, кодирующие синтез бактериоцинов. В случае штаммов            P. pentosaceus 23, 28, 55 можно говорить о хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов.

Для подтверждения плазмидной локализации детерминантов синтеза бактериоцинов у штаммов P. acidilactici 27 и 38 была проведена элиминация плазмид с новобиоцином и акридиновым оранжевым. После элиминации плазмид педиококки выращивали на среде с индикаторным штаммом S. epidermidis B-8933 и учитывали наличие или отсутствие зон задержки роста индикаторного штамма вокруг колоний педиококков (Ped⁺/Ped^-). Колонии без зон задержки роста проверяли на отсутствие плазмид (Ped^-).

                                                      

 

Рис. 13. Плазмидный профиль Ped⁺              Рис. 14. Плазмидный профиль Ped⁺ и Ped^-

M – плазмида pBRG1310 размером 12330 п.н.,             M – маркер GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder;

1 – P. pentosaceus 55; 2 – P. pentosaceus 23;    1 – P. acidilactici 27 (Ped⁺); 2 – P. acidilactici 38 (Ped⁺);

3 – P. acidilactici 27; 4 – P. pentosaceus 28;      3 – P. acidilactici 27 (Ped^-); 4 – P. acidilactici 38 (Ped^-).

5 – P. acidilactici 38;

S – суперскрученная форма плазмиды, L – линейная, C – кольцевая.

 

На картине электрофореза (рис. 14) видно, что Ped⁺ штаммы содержат плазмиду размером ~ 11 т.п.н., в то время как Ped^- штаммы плазмид не имеют. Таким образом, методом элиминирования плазмид, была установлена плазмидная локализация генов, кодирующих синтез бактериоцинов у штаммов P. acidilactici 27 и P. acidilactici 38.

Сверхпродукцию бактериоцинов, детерминируемых генами плазмиды, предлагается получать повышением копийности этих генов в результате мутации плазмид  по функции репликации. В случае хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов, имеет смысл помещать эти гены под контроль сильного промотора.

Гены, кодирующие глутаматдегидрогеназу. Повышение активности фермента глутаматдегидрогеназы стартовых культур позволит увеличивать количество ароматических соединений в ферментированных мясных продуктах. В связи с этим у штаммов S. carnosus 111-2 и L. plantarum 7K методом ПЦР были идентифицированы гены gdh, детерминирующие ГДГ активность (рис. 15). Методы генной инженерии, при использовании разработанной «Схемы получения суперэкспресии гена Y», позволят направленно улучшить свойства микроорганизмов для получения регулируемой суперэкспресии гена gdh фермента глутаматдегидрогеназы.

Определение генетических детерминантов супероксиддисмутазы. Для мясной промышленности важно селекционировать стартовые культуры, устойчивые к окислительному стрессу. Поэтому у штамма, представителя каждого вида, был выделен ген, кодирующий фермент СОД (рис. 16). У штаммов L. curvatus 2, L. plantarum 7К,           L. sakei 104 и L. casei 10 был найден ген sodA размером 454 п.н., у S. carnosus 108 и                     S. xylosus 45 размер гена sodA составил 503 п.н. У штаммов, относящихся к видам Pediococcus spp., гена sodA, ответственного за синтез фермента супероксиддисмутазы, обнаружено не было. Изменение активности экспрессии генов sodA, кодирующих фермент СОД, при использовании разработанной «Схемы получения суперэкспресии гена Y», позволит не только получать устойчивые к окислительному стрессу штаммы, но и создавать промышленно-ценные микроорганизмы, способные замедлять окислительную порчу мясопродуктов.

                       

 

Рис. 15. Картина электрофореза глутаматдегидрогеназных генов gdh

Обозначения: L. plantarum 7К – 1347 п.н. (температура отжига праймеров 55 °С и 57 °С), S. carnosus 111-2 – 1245 п.н. (температура отжига праймеров 49 °С и 51 °С), М – маркер GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder

Рис. 16. Картина  электрофореза супероксиддисмутазных  генов

Обозначение: 1 – L. curvatus 2, 2 –                          L. plantarum 7К, 3 – L. sakei 104, 4 – L. casei 10, 5 – S. carnosus 108, 6 – S. xylosus 45,              M – маркер GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder

 

 

Глава 8. Методология  создания бактериальных препаратов на основе стартовых культур по совокупности их функциональных свойств 

 

Изучение  возможности совместного использования микроорганизмов различных видов в бактериальных препаратах

В основном в промышленности применяют многоштаммовые бактериальные  препараты, поэтому задача отбора микроорганизмов состоит не только в выборе оптимальных по функциональным свойствам для конкретного продукта штаммов, но также штаммов, обладающих взаимной совместимостью. В связи с этим была изучена способность к совместному росту и размножению выделенных штаммов молочнокислых микроорганизмов, стафилококков, а также дрожжей и мицелиальных грибов.

На примере штаммов, относящихся к видам L. plantarum, L. casei, S. carnosus,                   P. acidilactici, P. pentosaceus было показано отсутствие антагонизма между этими микроорганизмами методом перпендикулярных штрихов. На снимках видно, что при одновременном культивировании исследуемых штаммов друг с другом негативного влияния на их морфологию и рост обнаружено не было (рис. 17 (а) и (б)).

               

                    а)                                                    б)                                                   в)

Рис. 17. Совместный рост штаммов

а) L. plantarum B-2663, L. plantarum B-8899, S. carnosus B-8953, б) P. acidilactici В-8902, P. pentosaceus В-8888 и L. casei В-8890, в) L. plantarum B-2663, L. plantarum В-1618, L. plantarum В-8654.

На рис. 17 (в) видны зоны антагонизма между микроорганизмами одного вида                   L. plantarum. Штаммы по кислотообразованию близки друг к другу, активная кислотность L. plantarum B-2663 составляет 65 °Т, L. plantarum В-1618 – 79 °Т, L. plantarum В-8654 – 73 °Т, поэтому объяснить антагонизм продуцированием молочной кислоты нельзя. В данном случае можно говорить о синтезе бактериоцинов штаммом L. plantarum B-2663, подавляющих рост микроорганизмов гомологичного вида. 

Были изучены взаимоотношения между дрожжами видов D. hansenii, D. vanriji,               D. polymorphus и мицелиальными грибами вида P. camembertii, которые также не показали антагонизма.

Применение  ДНК-фингерпринта для паспортизации  промышленно-ценных микроорганизмов

Для паспортизации промышленных микроорганизмов был проведен ДНК-фингерпринт (геномная дактилоскопия), который используется для идентификации штаммов на таксономическом уровне до штамма. Данный уровень идентификации зависит  от выбора штаммоспецифичных праймеров. Идентификация на уровне штамма позволяет точно говорить, что данный штамм, используемый в промышленности, идентичен той культуре, которая была депонирована или же запатентована, разрешена к использованию в пищевой промышленности и будет проявлять нужные в технологическом процессе свойства. ДНК-фингерпринт позволяет обезопасить производство и оградить автора данной культуры от незаконного ее использования.

Создание  программы с базой данных функциональных свойств стартовых культур

   Полный целенаправленный отбор микроорганизмов для бактериальных препаратов  при наличии большого числа коллекционных культур возможен лишь при использовании вычислительной техники. Компьютерная техника позволяет быстро, с учетом заданных параметров, произвести выбор штаммов, оптимальных для определенных условий производства. В связи с этим была создана программа с базой данных функциональных свойств стартовых культур. Программа имеет иерархическую структуру и позволяет производить ранжирование, статистическую обработку, расчет и оценку по количественным критериям. Очень важно, что эта программа способна выстраивать штаммы в порядке приоритета.

Система «База данных микроорганизмов» написана на языке Java и выполняется в среде исполнения JRE версии 5.0 или выше. Для хранения данных используется единый файл «micro.db», создаваемый при необходимости в рабочем каталоге системы. Система является переносимой и способна выполняться на всех поддерживаемых JRE ОС. Тестировалась система на ОС Windows XP и Mac OS X 10.4.

Интерфейс системы построен в виде экранных форм и диалоговых окон, в которых выполняется вся работа по выборке данных и внесению новых данных в базу данных. На главной форме программы расположено главное меню, позволяющее обращаться к другим формам, и область статистики, где выводится количество зарегистрированных в базе данных сущностей. Внутреннее представление данных выполнено в виде реляционных таблиц (рис. 18).

Результаты исследований позволили разработать методологию  создания функциональных бактериальных  препаратов, представленную на рис. 19.

 

Рис. 18. Структура  реляционной базы данных

 

Рис. 19. Методология  создания функциональных бактериальных  препаратов

Глава 9. Оценка эффективности влияния стартовых  культур на качественные характеристики модельных мясных систем и готовых мясных продуктов

 

При проведении оценки эффективности  было уделено внимание получению  продуктов не только традиционными  методами, но и с привлечением нестандартного мясного сырья, биотрансформированного стартовыми культурами, которое, в силу своих качественных особенностей, не может быть использовано в нативном виде. Было изучено влияние стартовых культур на изменение характеристик мясного сырья, в том числе нестандартного, а также мясных продуктов.

 

Цветообразование  и снижение остаточного нитрита натрия

 

Оценку эффективности  бактериального препарата «Биоцвет», в состав которого входит штамм S. carnosus LIA-96, в отношении цветообразования и снижения остаточного нитрита натрия, проводили с использованием модельной фаршевой системы, состоящей из фарша (говядина + свинина, 1 : 2), глюкозы (2%), MgSO₄ (0,00035%) и нитрита натрия до конечной концентрации 3, 5 и 7,5 мг на 100 г фарша. В качестве контроля использовали штамм S. carnosus B-8953. В обоих случаях количество КОЕ составило 2×10⁹ на 100 г фарша. Образцы выдерживали в анаэростате при 24 °С, пробы отбирали через равные промежутки времени. Динамика изменения концентрации нитрита натрия с использованием в качестве стартовой культуры штамма-продуцента S. carnosus LIA-96 и исходного штамма S. carnosus B-8953 при введении нитрита натрия 3, 5 и 7,5 мг на 100 г, показана на рис. 20–22, соответственно. Во всех образцах, в которые был внесен штамм               S. carnosus B-8953, за 18 ч ферментации не произошло полного восстановления нитрита, а при внесении в образцы штамма S. carnosus LIA-96 нитрит не обнаруживался через 6 ч при его введении 3 мг/100 г фарша; через 10 ч – 5 мг/100 г и через 14 ч – 7,5 мг/100 г. В случае со штаммом S. carnosus B-8953 при повышении концентрации нитрита натрия происходила задержка начала активного восстановления ионов нитрита, в случае применения штамма S. carnosus LIA-96 данного явления не наблюдалось. Это связано с разной регуляцией активности nir-оперона промоторами этих штаммов. Поскольку у штамма S. carnosus LIA-96 сила промотора Pgap выше, происходило более быстрое накопление белкового продукта nir-оперона и последующее активное восстановление токсичного для микробной клетки нитрита. В случае же промотора Pnir у штамма                      S. carnosus B-8953 происходила постепенная активизация синтеза белка nir-опероном, а, следовательно, задержка начала активного роста бактерий.