Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мя

 

Дрожжи  и мицелиальные грибы

 

Идентификация дрожжей  проводилась по совокупности микро- и макроморфологических свойств. В  результате было отобрано шесть штаммов дрожжей. По совокупности определенных признаков при использовании определителя дрожжей (Nakase T., 1998) полученные штаммы были идентифицированы как Debaryomyces vanriji Dji, D. hansenii Dhi, D. polymorphus Dps, Candida famata КФ-1, КФ-2, КФ-3. Штаммы находятся на национальном патентном депонировании в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами Y-3140, Y-3139, Y-3138, Y-3129, Y-3130, Y-3128 соответственно, что подтверждается справками о депонировании.

Идентификацию грибов проводили путем культивирования на различных питательных средах (агар Чапека с дрожжевым экстрактом, сусло-агар, нитратный агар с глицерином) и определения их культуральных и морфологических признаков.

Для того чтобы исключить  риск использования в пищевой  промышленности микроорганизмов, способных синтезировать микотоксины, у выделенных штаммов мицелиальных грибов вида P. camembertii были исследованы вторичные метаболиты, и проведен среди них поиск микотоксинов: ЦПК и ругуловазинов А и В. Полученные в результате ТСХ данные показали, что ни один из штаммов P. camembertii ПК-1, ПК-2, ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7 не продуцирует характерные для данного вида мицелиальных грибов микотоксины, а именно ЦПК и ругуловазины А и В, о чем свидетельствует приведенная хроматографическая пластина (рис. 2). По итогам проведенной работы были отобраны шесть штаммов мицелиальных грибов, относящихся к виду Penicillium camembertii ПК-1, ПК-2, ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7, которые находятся в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами F-905, F-885, F-906, F-907, F-908, F-884 соответственно, что подтверждается справками о национальном патентном депонировании.

 

Рис. 2. Определение  ругуловазинов А и В, и ЦПК  в условиях глубинного культивирования  на среде Абе

Обозначения: 1 – ПК-1 (6 сут), 2 – ПК-1 (12 сут); 3 – ПК-2 (6 сут), 4 – ПК-2 (12 сут); 5 – ПК-3 (6 сут),          6 – ПК-3 (12 сут); 7 – С-47 (контроль ругуловазинов А и В); 8 – F-3088 (контроль ЦПК); 9 – ПК-4                 (6 сут), 10 – ПК-4 (12 сут); 11 – ПК-5 (6 сут), 12 – ПК-5 (12 сут); 13 – ПК-7 (6 сут), 14 – ПК-7 (12 сут)

 

Неправильная идентификация  микроорганизмов не только не позволит получить продукт с заданными  свойствами и характеристиками, но и может нести угрозу безопасности ферментированных продуктов, поэтому для идентификации должен быть использован комплекс всех доступных фенотипических и генотипических методов.

 

Глава 4. Определение  безопасности стартовых культур

 

Антибиотикоустойчивость промышленных культур и пути предотвращения распространения ее детерминантов

В последнее время, в  связи с глобальным распространением явления антибиотикоустойчивости у микробов, влекущего за собой рост неблагоприятных последствий для человека (снижение эффективности лечения различных широко распространенных заболеваний, повышение тяжести инфекций, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, усиление агрессивных свойств возбудителей и т.д.), в мире стало уделяться повышенное внимание такому важному критерию отбора микроорганизмов для промышленных целей как отсутствие антибиотикоустойчивости, связанной с эффективно распространяющимися путем горизонтального переноса генетическими факторами. Такие генетические факторы могут, в частности, передаваться с высокой частотой от лактобактерий к патогенным микроорганизмам и наоборот.

Возможность горизонтального  переноса генов устойчивости к антибиотикам повышается при локализации этих генов в составе плазмид и транспозонов. Следует учитывать, что плазмиды широко распространенны среди всех видов молочнокислых бактерий, и ряд плазмид кодирует важные технологические свойства. Наличие плазмид у стартовых культур и пробиотиков может не представлять опасности, если штаммы не содержат трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам.

Устойчивость к антибиотикам штаммов промышленных микроорганизмов  сама по себе не является вредным фактором. В некоторых случаях природная  устойчивость может быть полезной для  стабилизации микрофлоры кишечника  при проведении антибиотикотерапии. В то же время, при рекомендации к использованию в пищевой промышленности штаммов молочнокислых микроорганизмов необходимо учитывать опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Проведение анализа  проблемы распространения антибиотикоустойчивости позволило определить пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости молочнокислыми бактериями. Для этого необходимо:

• обязательно оценивать культуры стандартизованными методами на устойчивость к антибиотикам;
• развивать критерии и методологию контроля промышленных микроорганизмов в сырье и пищевых продуктах при их допуске в производство и находящихся в обороте;
• создать информативную базу минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков и пограничных значений МПК природной устойчивости;
• создать базу данных генетических элементов, определяющих антибиотикоустойчивость бактериальной клетки, способных с высокой частотой распространяться горизонтальным путем;
• проводить поиск новых промышленных штаммов, не содержащих генов приобретенной устойчивости к антибиотикам.

Выполнение данных положений  имеет большое значение для отбора безопасных стартовых культур и  пробиотиков, не несущих трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости. У выделенных и идентифицированных микроорганизмов была определена устойчивость к антибиотикам различных групп, включая ингибиторы синтеза клеточной стенки, белка, нуклеиновых кислот и ингибиторы функции цитоплазматических мембран.

  Таблица 1

Определение устойчивости к антибиотикам лактобактерий

АНТИБИОТИКИ	L. sakei 105	L. curvatus 1	L. curvatus 102	L. sakei 104	L. casei 10	L. curvatus 2	L. sakei 35	L. sakei 45
Ингибиторы  синтеза клеточной стенки
ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Метициллин М         5 мкг	29 S	21 S	21 S	24 S	21 S	36 S	21 S	19 S
Пенициллин  G Р          10 ед	38 S	36 S	40 S	35 S	33 S	40 S	35 S	30 S
ЦЕФАЛОСПОРИНЫ
Цефалоридин Cr         30 мкг	32 S	15 I	19 S	18 S	10 R	29 S	6 R	6 R
Ингибиторы  синтеза белка
АМИНОГЛИКОЗИДЫ
Канамицин К          30 мкг	11 R	17 I	18 S	14 I	6 R	24 S	6 R	6 R
Тобрамицин Tb        10 мкг	17 S	18 S	17 S	15 S	6 R	22 S	6 R	6 R
ЛИНКОЗАМИДЫ
Линкомицин L            2 мкг	35 S	38 S	39 S	28 S	20 I	38 S	23 S	32 S
МАКРОЛИДЫ
Олеандомицин Ol         15 мкг	23 S	22 S	24 S	20 S	17 I	28 S	18 S	16 S
Ингибиторы  синтеза нуклеиновых кислот
ХИНОЛОНЫ
Норфлоксацин Nx        10 мкг	18 I	22 S	25 S	16 I	10 R	34 S	6 R	6 R

Обозначения: R – устойчивый, I – умеренно устойчивый, S – чувствительный.

Цифры обозначают диаметры задержки роста штаммов вокруг дисков с  антибиотиками, мм.

Как видно из табл. 1, все  штаммы оказались чувствительными  к пенициллину G, метициллину. Вариабельность была зафиксирована в отношении цефалоридина, норфлоксацина и аминогликозидов. Устойчивость к этим антибиотикам является природной. Умеренная устойчивость в отношении линкомицина (группа линкозамиды) и олеандомицина (группа макролиды) была характерна только для L. casei 10. В данном случае прослеживается перекрестная умеренная устойчивость к линкозамиду и макролиду.

По результатам работы были выбраны  микроорганизмы, не способные к распространению  генов антибиотикоустойчивости. Это  позволит предотвратить опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

 

Определение факторов вирулентности у штаммов  вида Enterococcus  faecalis

Штаммы молочнокислых  энтерококков в последнее время  все чаще предлагается использовать в качестве пробиотиков для улучшения микробного баланса тонкого кишечника. Неоднозначное отношение к энтерококкам связано с тем, что, будучи частью нормальной микрофлоры, они являются и одним из важнейших возбудителей госпитальных инфекций, и отсутствие факторов патогенности – главный и обязательный критерий при оценке возможности использования бактерий рода Enterococcus в пищевой промышленности, а также в качестве пробиотиков. Во многих случаях патогенность не является видовым признаком микроорганизма.

Разработанные на сегодняшний  день тесты, в том числе генетические, позволяют выявить степень безопасности энтерококковых штаммов. Исследования проводились со штаммами E. faecalis 31, E. faecalis 55, E. faecalis 59. Для сравнения были взяты штаммы Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P, S. epidermidis В-8940, типовой штамм E. faecalis В-4610, у которого ранее были обнаружены гены патогенности: agg (прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки), gelE (синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов) и cylМВA (синтез цитолизина, где cylM – посттрансляционная модификация цитолизина; cylB – транспорт цитолизина; cylA – активация цитолизина). Проведение исследований на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности, поэтому следующим этапом было проведение ПЦР-генотипирования штаммов.

       

                                    а)                                                                      б)

Рис. 3. Электрофорез фрагментов генов: а – agg, б – gelE

Обозначения: М1 – маркер GeneRuler^тм 100 bp DNA Ladder, Fermentas; М2 – маркер DNA Ladder, Mix,  Fermentas; 1 – E. faecalis 31; 2 – E. faecalis 59; 3 – E. faecalis 55; 4 – E. faecalis B-4610

Результаты показали присутствие генов вирулентности agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis (рис. 3), что не позволяет их использовать в качестве стартовых культур и пробиотиков. Применение данного подхода к изучению и отбору энтерококков позволит создавать качественные и безопасные отечественные бактериальные препараты.

 

Обеспечение безопасности ферментированных мясопродуктов  амино-негативными стартовыми культурами

 

Выбор стартовых культур  является основой для гарантии качества готового продукта в отношении содержания биогенных аминов. Поэтому, неспособность к образованию БА в течение всего технологического цикла и в процессе хранения должна быть одним из основных критериев для выбора стартовых культур при производстве ферментированных мясопродуктов. Уровень декарбоксилазной активности in vitro у микроорганизмов, вызывающих существенное повышение концентрации БА (свыше 100 мг/кг продукта), составляет 350 мг/л скрининговой среды. Микроорганизмы, образующие в скрининговой среде БА в количестве, меньшем, чем 350 мг/л, считаются амино-негативными (Bover-Cid S., 1999).

Так как основной задачей  было определить штаммы с уровнем  активности ниже критического, на первом этапе отбирались штаммы, не имеющие вообще декарбоксилазной активности (на тестовой среде), а на втором этапе были определены уровни активности образования БА среди остальных микроорганизмов методом ВЭЖХ.

Были получены следующие  результаты: из 48 исследованных штаммов  только 3 имеют декарбоксилазную активность по отношению к гистидину, 18 – к тирозину, 29 – к лизину и 36 – к тирозину. Штаммы P. claussenii 9, L. casei 10, L. sakei 19, P. pentosaceus 25, L. sakei 45 не обладают декарбоксилазной активностью в отношении выбранных аминокислот, а штамм P. pentosaceus 106 имеет декарбоксилазную активность по отношению ко всем аминокислотам. На рис. 4 представлены хроматограммы образцов гистамин-негативного штамма P. pentosaceus 106 и тирамин-позитивного микроорганизма L. sakei 105.

         

         а)                                                                                б)

Рис. 4. Хроматограммы  а) гистамин-негативного штамма Pediococcus pentosaceus 106 и б) тирамин-позитивного штамма Lactobacillus sakei 105

По оси Х указано  время анализа, мин; по осу Y – сигнал детектора, AU.

Результаты исследования показали, что уровень образования  гистамина был низким для P. pentosaceus 106 – 4,32 мг/л, L. curvatus CDN – 6,61 мг/л, S. xylosus 45 – 5,65 мг/мл. Путресцин продуцировали 77% штаммов, но в незначительном количестве (в пределах 0,117–10,65 мг/л). S. xylosus P-1, стартовая культура, входящая в состав коммерческого импортного бактериального препарата, в культуральном бульоне накапливала путресцин в количестве 63,35 мг/л. Независимо от их видовой принадлежности, продуцировали кадаверин (от 0,192 до 11,13 мг/л) 40% штаммов. Три штамма L. sakei 101, 103, 105 были определены как амино-позитивные, так как продуцировали тирамин выше обозначенного уровня 350 мг/л (468,19, 477,75 и 581,18 мг/л, соответственно). В данном случае можно говорить, что высокая активность тирозиндекарбоксилазы характерна для вида L. sakei. Количество тирамина, образуемого остальными штаммами, не превышало 2 мг/л. В результате были отобраны отечественные штаммы, низкая декарбоксилазная активность которых (или полное ее отсутствие) позволит использовать их в мясной промышленности в качестве стартовых культур.