Шпаргалка "Молекулярная биология"

У всех людей ~ 30х1013 генов  или 30х1016 пар нуклеотидов, которые  составляют 1017 кодонов.

Средняя книжная страница содержит 25х102 знаков. ДНК 6х109 сперматозоидов содержит информацию, равную по объему примерно 4х1013 книжных страниц. Эти  страницы заняли бы объем 6-и зданий МГУ.

6х109 сперматозоидов занимают  половину наперстка. Их ДНК  занимает менее четверти наперстка. 

 

31. Транскрипция.

Определение: транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом  ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

• У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
• У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
• Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей актвированных нуклеотидов.

 

 

32. Принципы транскрипции.

1. Комплементарность. 2. Антипараллельность. 3. Униполярность. 4. Беззатравочность.

5. Асимметричность.

РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'→3'. Для начала синтеза  РНК фермент не нуждается в  поли- или олигонуклеотидной затравке.

Первый нуклеотид в  РНК всегда пурин в форме трифосфата.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

33. Субъединичный состав РНК-полимеразы  E. coli.

РНК-полимераза Е.coli - белок  с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул  РНК-полимеразы.

Субъединичный состав фермента: (2^α)ββ̓σ - holo-фермент (полный фе рмент). Без σ -фактора это core-фермент (2^α)ββ̓.

                           σ(сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.

Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.

Сам по себе σ- фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.

Как только произошла инициация  транскрипции, σ-фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.

Стадии узнавания и  связывания, а также инициации  осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.

Две α-субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.

β̓- субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.

В β- субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

 

34. Особенности структуры промотора. 

Для изучения структуры промоторов провели следующий эксперимент.

При оптимальных условиях связывания получили комплекс РНК-полимеразы с ДНК.

Этот комплекс обработали ДНК-азой, и таким образом гидролизовали  всю ДНК, незащищенную РНК-полимеразой.

После этого отделили РНК-полимеразу от оставшихся фрагментов ДНК.

Опять создали оптимальные  условия для образования комплекса. Комплекс не образовывался.

Отсюда следует вывод, что узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК.

Эти участки отличаются и  по первичной, и по вторичной структуре.

Путем секвенирования выявили  структуру многих промоторов. У большинства  из них имеется общее свойство.

РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов.

В промоторе узнается взаимное расположение двух расплавленных AT-богатых  участков. В каждом из них 

35. Этапы транскрипции.

1. Узнавание и прочное связывание

Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся  в b-субъединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора.

2.Инициация заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации σ- фактор покидает фермент.

3. Элонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции).

Скорость элонгации 40-50 нукл./сек.

Для комплементарного синтеза  РНК необходим разрыв водородных связей в ДНК. Core-фермент РНК- полимеразы покрывает примерно 40 пар нуклеотидов (4 витка спирали ДНК). Разрыв водородных связей на 4-х витках спирали - очень энергоемкий процесс. Он не был обнаружен при изучении транскрипции.

РНК-полимераза переводит  ДНК из В-формы в А-форму.

В ней плоскости азотистых  оснований не перпендикулярны оси  спирали, а наклонены на 200 к перпендикуляру.

Это облегчает "выворачивание" двух соседних азотистых оснований  в цепи ДНК для того, чтобы напротив них встали комплементарные нуклеотиды РНК.

В пользу этого говорит  полная идентичность параметров А-формы  ДНК и гибрида, состоящего из одной  цепи ДНК и одной - РНК.

"Мотором" транскрипции  является энергия, высвобождающаяся  при отщеплении пирофосфата от  каждого рибо-НТФ. 

Ингибиторы транскрипции прокариот

Существует множество  ингибиторов транскрипции. Они действуют  по разным механизмам и на разных стадиях. Большинство из них - антибиотики.

Рифампицин - ингибитор инициации.  
Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы E. сoli.

Стрептолидигин - ингибитор элонгации.  
Связывается с центром элонгации core-РНК-полимеразы E. сoli.

Терминация Специфическая терминация бывает r- независимой и r- зависимой.

При r- независимой терминации в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК.

r- фактор - это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью.  
Он способен узнавать 5`-конец синтезируемой РНК длиной приблизительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК.

В терминаторе  много Г-Ц пар (с тремя водородными связями), вследствие чего РНК-полимераза замедляет ход, r- фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается.

 

 

 

 

 

расплавлено 4-6 пар. Центры этих участков находятся в положенях "-10" и "-35".

Принципиально важным является расстояние между расплавленными участками.

Оно колеблется от 16 до 19 п.н.

Искусственное увеличение этого  расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что  РНК-полимераза не узнает испорченный  промотор.

 

36. Палиндромы.  Примерно 5% промоторов у прокариот имеют только участок "-10", однако, тем не менее, хорошо узнаются РНК-полимеразой.

Такие промоторы  представлены палиндромными последовательностями, принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.

Определение: палиндромы - последовательности, которые  читаются одинаково слева направо  и справа налево.

Палиндромы первого  порядка имеют одну ось симметрии, второго - две, третьего - три.

 

37. Схема негативной индукции Жакоба  и Моно.

Lac-оперон E. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков, участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.

Z - b- галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).

Y- b- галактозидпермеаза (переносит лактозу через мембрану клетки).

А - тиогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).

В отсутствие в клетке лактозы lac- оперон выключен.

Активный белок - репрессор, кодируемый в моноцистронном опероне (LacI) , не имеющем оператора, связан с оператором lac-оперона.

Поскольку оператор перекрывается  с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на промотор невозможна.

Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку, две  молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют  с белком - репрессором, изменяют его  конформацию - и он теряеет сродство к оператору.

Тут же начинается транскрипция lac-оперона и трансляция образующейся mРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы.

Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает lac-оперон.

Эта схема  называется так потому, что контролирующим транскрипцию фактором является негативный фактор, "выключатель" - белок - репрессор.

 Индукция (включение) происходит при потере  сродства белка - репрессора к  оператору.

 

 

38. Схема позитивной индукции.

Аra-оперон E. сoli.

В нем 3 цистрона, которые  кодируют ферменты, расщепляющие сахар  арабинозу.

В норме оперон закрыт. Белок - репрессор связан с оператором.

Когда в клетку попадает арабиноза, она взаимодействует  с белком - репрессором.

39. Схема позитивной репрессии.

Оперон синтеза рибофлавина у Вacilus subtilis.

В опероне располагаются  цистроны ферментов синтеза рибофлавина.

Есть белок-активатор, обеспечивающий посадку РНК-полимеразы на промотор.

В норме оперон открыт. Образуется N молекул рибофлавина.

N+1-ая молекула (лишняя) взаимодействует  с активатором и он теряет способность активировать посадку РНК-полимеразы на промотор.

Позитивная  репрессия, поскольку в регуляции  участвует белок - активатор, а сама регуляция заключается в выключении транскрипции.

 

 

 

40. Схема негативной репрессии.

Оперон синтеза триптофана у E. сoli.

В опероне имеется 5 цистронов, которые кодируют ферменты последовательной цепи реакций синтеза триптофана.

В норме оперон включен.

Белок - репрессор неактивен (в форме апо-репрессора), он не способен садиться на оператор.

Клетке нужно N молекул  триптофана.

N+1-ая молекула взаимодействует  с апо-репрессором. 

Он меняет конформацию, садится  на оператор и синтез РНК прекращается.

Схема регуляции - негативная репрессия, потому что белок репрессор "выключает" оперон.

Помимо "грубой схемы" включения - выключения, есть и тонкая регуляция синтеза триптофана - аттенуация

    

 

 

 

 

 

 

 

Белок - репрессор меняет конформацию и превращается из репрессора в активатор, взаимодейсивующий  с промотором и облегчающий посадку  РНК-полимеразы на промотор.

Эта схема регуляции называется позитивной индукцией, поскольку контролирующий элемент - белок - активатор "включает" работу оперона.

 

 

 

41. Позитивный контроль работы lac-оперона.

Lac-оперон, подчиняющийся схеме негативной индукции, имеет и позитивный контроль.

цАМФ образуется из АТФ ферментом аденилатциклазой.

Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ.

Глюкоза активирует второй и инактивирует первый фермент.

Чем больше в клетке глюкозы, тем меньше цАМФ.

Если нет глюкозы, то цАМФ соединяется с белком катаболической репрессии (САР) и образуется комплекс САР·цАМФ, активирующий посадку РНК-полимеразы на промотор.

В присутствии лактозы lac-оперон включается и работает.

Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный  источнок энергии), то нет цАМФ - и  активатор не образуется, lac-оперон работает "вяло", без дополнительной индукции.

 

42. Структура транспортной РНК.

Транспортные  РНК (tРНК) - короткие молекулы (70-90 нукл.), имеющие и вторичную, и третичную структуру.

Вторичная структура - "клеверный  лист". Последовательность CCA на 3'-конце  одинакова для всех tРНК. К концевому аденозину (А) присоединяется аминокислота.Наличие в tРНК тимина (T), псевдоуридина( y) (в TyC- петле ), и дигидроуридина (ДГУ) (в D-петле) - минорных, т.е. редко встречающихся в РНК нуклеотидов, указывает на особенности ее строения, необходимые для безошибочного узнавания