Шпаргалка "Молекулярная биология"

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

43. Рекогниция. Синтез белка в клетке состоит из двух этапов:

• рекогниции. Ключевым субстратом рекогниции является транспортная РНК.
• собственно синтеза полипептида на рибосоме.

Определение: рекогниция - это подготовительный этап трансляции, суть которого в образовании  ковалентной связи между tРНК и соответствующей аминокислотой.

Состоит из двух стадий:

• 1. Активирование аминокислоты.
• 2. Присоединение аминокислоты к tРНК - аминоацилирование.

Обе стадии рекогниции осуществляются ферментом аминоацил-tРНК-синтетазой (APC-азой, кодазой).

Существует 20 вариантов кодаз (по числу аминокислот). У каждой кодазы 3 центра опознавания. Каждая АРС-аза  узнает третичную структуру tРНК.

Определение: tРНК, имеющие разную первичную, но одинаковую третичную структуру, акцептируют одну и ту же аминокислоту и называются изоакцепторными tРНК.

Есть особая tРНК, которая называется формилметиониновой tРНК. Она узнается метиониновой кодазой, соединяется с метионином и уже после реакции аминоацилирования метионин формилируется специальным ферментом который узнает эту особую форму tРНК.

Именно с формилметионина начинается синтез любого полипептида у прокариот.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ферментами, для защиты от действия рибонуклеаз (поэтому tРНК - долгоживущие, в отличие от mРНК).

Третичная структура в  проекции на плоскость имеет форму  бумеранга. Разнообразие первичных структур tРНК - 61+1 - по количеству кодонов (соответственно числу антикодонов в tРНК) + формилметиониновая tРНК, у которой антикодон такой же, как у метиониновой tРНК. Разнообразие третичных структур - 20 (по количеству аминокислот).

 

 

45. Структура рибосом.

Рибосомы - немембранные самые мелкие клеточные органеллы, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке E. сoli присутствует около 103-5х103 рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290 Å. У эукариот - 220 х 320 Å.

Выделяют четыре класса рибосом:

1. Прокариотические 70S.

2. Эукариотические 80S.

3. Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов).

4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).

Определение: S - коэффициент  седиментации или константа Сведберга. Отражает скорость осаждения молекул  или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного  веса.

Каждая рибосома состоит  из 2-х субъединиц (большой и малой). Таблица в тетради.

Сложность объясняется тем, что все элементы рибосом представлены в одном экземпляре, за исключением  одного белка, присутствующего в 4 копиях в 50S субъединице, и не могут быть заменены.

rРНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.

23S rРНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S rРНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона mРНК, 5S rРНК - для правильной ориентации аминоацил-tРНК на рибосоме.

Все rРНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.

rРНК в значительной степени метилированы (СН3-группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).

Порядок сборки субъединиц из rРНК и белков строго определен.

Субъединицы, не соединенные  друг с другом, представляют собой  диссоциированные рибосомы.

Соединенные - ассоциированные  рибосомы.

Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg2+ (до 2х103 ионов  на рибосому).

Магний нужен для компенсации  отрицательного заряда rРНК.

Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg2+ (в  меньшей степени - марганца Mn2+).

 

 

 

 

47. Синтез полипептидов на рибосоме.

У прокариот перед каждым геном и соответственно в mРНК перед копией каждого гена имеется лидерная последовательность.

Она может быть разного  размера (до 160 нукл.) и разной первичной  структуры, но обязательно содержит полипуриновую последовательность Шайна-Дальгарно, которая комплементарна 3'-концевому участку 16S rРНК. Комплементарными могут быть 3-9 нуклеотидов.

Назначение  комплементарного взаимодействия 3'-концевого  участка 16S rРНК и последовательности Шайна-Дальгарно - правильная установка инициирующего кодона AUG на малой субъединице рибосомы.

Инициирующий кодон находится  на растоянии 3-10 нукл. от последовательности Шайна-Дальгарно.

К малой субъединице, на которой  уже находится mРНК, подходит формилметиониновая tРНК, соединенная с формилметионином. В результате образуется инициаторный комплекс:

30S субъединица  рибосомы + mРНК + формилметионовая tРНК-формилметионин.

Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется конформация 16S rРНК и нарушается связь между ней и последовательностью Шайна-Дальгарно.

Аминоацильный конец формилметиониновой tРНК оказывается в Р-центре. Второй кодон гена оказывается в Асп-центре. Соответствующая ему аминоацил-tРНК устанавливается таким образом, что ее аминоацильный конец попадает в А-центр.

Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин в Р-центре и переносит  его в А-центр. Образуется пептидная  связь между формилметионином и  аминоацил-tРНК.

Рибосома претерпевает конформационные  изменения и сдвигается на один кодон. Формилметиониновая tРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается напротив Р-центра. Сюда же переходит tРНК, несущая на хвосте дипептид. В Асп-центр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-tРНК.

Теперь в Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр  и соединяется с третьей аминоацил-tРНК. Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не приходит терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре, переносится в А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он отваливается от рибосомы. Рибосома диссоциирует и малая субъединица сканирует mРНК.

In vivo на каждой стадии (образования инициаторного комплекса, инициации, элонгации и терминации) участвуют различные белковые факторы, которые препятствуют посадке на рибосому деацилированных tРНК или запрещают посадку формилметиониновой-tРНК в А-центр.

На всех этапах принимают  участие молекулы ГТФ, которые дефосфорилируются.

Смысл гидролиза  ГТФ не в отдаче энергии, а в  свидетельстве того, что данный этап трансляции пройден.

Все синтезируемые полипептиды  прокариот на N-конце несут формилметионин. В 20% случаев он отщепляется, а в 80% отщепляется только формильная группа и на N конце остается метионин.

 

 

 

 

46. Каталитические центры рибосом.

Асп - центр  специфического узнавания.  
Здесь происходит взаимодействие кодон-антикодон.

Р-центр - пептидильный, донорный. 
Он является донором формилметионина при инициации, или пептидила при элонгации трансляции.

А-центр - аминоацильный, акцепторный.  
Акцептирует формилметионин в самом начале или пептидил при элонгации трансляции.

К-центр - каталитический (фермент пептидилтрансфераза).  
В К-центре задействована 23S rРНК и несколько белков большой субъединицы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

48. Регуляция образования рибосомных  РНК и белков рибосом E.сoli

Ежеминутно в E.сoli образуется около 500 рибосом (всего в клетке 10000-50000 рибосом).

Имеется 7 оперонов, в которых  закодированы rРНК (всего 3 разных rРНК х 7оперонов = 21 ген). В формировании рибосом участвуют 52 различных белка, а значит 52 гена, их кодирующих. В итоге,

73 гена должны  работать координированно, чтобы  не было избытка белков или  rРНК.

Вначале образуется про-rРНК, которая метилируется и процессируется (т.е. "созревает").

Количество rРНК регулируется количеством рибосомных оперонов, скоростью их транскрипции и работой ферментов метилаз и эндонуклеаз.

Имеется 7 разных оперонов, в  которых закодированы рибосомные белки. Регуляция каждого из них осуществляется отдельно.

a-оперон регулируется белком S4.

Если в клетке имеется  свободная 16S rРНК, то S4 связывется с ней (1).

Если же 16S rРНК не хватает, то он связывается с mРНК, считывающейся с данного оперона (2).

Причем связывается в  районе лидера и тем самым мешает трансляции.

Таким образом, осуществляется регуляция на уровне трансляции

Оперон S10 регулируется белком L4.

РНК-полимераза синтезирует  первую лидерную последовательность, длиной 140 нукл. Если 23S rРНК не хватает (2), то белку L4 не с чем соединяться, и он взаимодействует с лидерной последовательностью, придавая ей такую конформацию, которая не позволяет РНК-полимеразе продолжать транскрипцию.

В результате синтез mРНК обрывается на первом же лидере (2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

49. Транскрипция у эукариот.

У эукариот процессы транскрипции и трансляции разобщены во времени и пространстве (транскрипция - в ядре, трансляция - в цитоплазме).

У эукариот существуют специализированные РНК-полимеразы.

В ядре выделяют 3 типа РНК-полимераз:

• РНК-полимераза I - синтезирует rРНК (кроме 5S rРНК).
• РНК-полимераза II - синтезирует mРНК и некоторые sРНК.
• РНК-полимераза III - синтезирует tРНК, некоторые sРНК и 5SrРНК.

РНК-полимеразы различаются  количеством субъединиц, их аминокислотным составом, и зависимостью от катионов магния и марганца.

Для РНК-полимераз I и III необходимое  для работы соотношение [Mn2+]/[Mg2+] = 2.

Для РНК-полимеразы II - [Mn2+]/[Mg2+] = 5.

Наиболее яркое различие - чувствительность к α - аманитину (токсину бледной поганки). Он полностью подавляет работу РНК-полимеразы II в концентрации 10-8 М и РНК-полимеразы III ( в концентрации 10-6 М). РНК-полимераза I фактически нечувствительна к этому токсину.

Помимо ядерных РНК-полимераз  у эукариот есть еще РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Они кодируются в ядре, а не в соответствующих органеллах.

В органеллах образуются свои tРНК, rРНК и рибосомные белки.

 

 

 

 

 

 

• Регуляция на уровне транскрипции Оперон s.

В этом опероне закодированы белки, имеющие принципиальное значение для инициации транскрипции (s-фактор), инициации репликации (dna G - праймаза) и инициации трансляции (белок S21).

Каждый белок нужен  в разном количестве. S21 ~ 50000 копий, dnaG ~ 50, s- фактор ~ 5000.

Между геном S21 и геном dnaG есть слабый терминатор транскрипции.

Ген dnaG имеет инициирующий кодон ГУГ (а не АУГ), который гораздо  хуже узнается рибосомой и реже, чем АУГ инициирует трансляцию.

 

 

 

50. Формирование рибосомы у эукариот.

Гены rРНК присутствуют в количестве от 10 до 105 копий у разных видов (105 у амфибий).

У человека - 300 генов, в которых  закодированы rРНК.

Все рибосомные гены, кроме  генов 5S рибосомной РНК, сближены (т.е располагаются один за другим) и образуют несколько кластеров.

Сначала синтезируется про-rРНК, после созревания которой образуются 28S, 18S и 5,8S rРНК.

Интерфазные хромосомы в  световой микроскоп не видны.

Каждый ген прорибосомной  РНК транскрибируется одновременно несколькими РНК-полимеразами и  тут же начинается процессинг.

На электронномикроскопических фотографиях видна картина "рождественской елочки".

Синтезируемые в ядре mРНК поступают на готовые рибосомы в цитоплазму, где синтезируются рибосомные белки, которые идут в ядро и путаются в "ветвях елки".

Образуются рибосомные субъединицы.

Одновременно в эукариотическом  ядре находятся сотни тысяч субъединиц рибосом.

Определение: ядрышко - место образования субъединиц рибосом, наблюдаемое в световой микроскоп.

В ядре может быть несколько ядрышек.

Определение: кластер генов rРНК называют ядрышковым организатором.