Хроматографические методы, используемые в фармацевтическом анализе

2. Хроматографическая колонка и количество сорбента.  
   Представляет собой стеклянную трубку, один из концов которой имеет пористую насадку или заткнут кусочком ваты, для того чтобы сорбент не высыпался. Длина колонки зависит от Rf разделяемых веществ. Чем меньше разница в Rf - тем длиннее колонка (слой сорбента). Пример: Для разделения 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 10 см. Ширина колонки зависит от количества (г) разделяемой смеси. Чем больше количество - тем шире колонка. Пример: Для разделения ~0.5 грамма смеси 2-х веществ с разницей в Rf ~ 0.4 требуется колонка около 2.5 см шириной.

3. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
• Требования к сорбенту.
1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента.Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al2O3 их удается эффективно очистить. 
2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта  или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот). Пример 1: Rf = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример 2: Rf = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или  высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
4. Приемники фракций. Для сбора фракций можно использовать как обычные плоскодонные колбы (A), так и пробирки (Б). Когда разделяемые вещества окрашены, видно как они выходят с колонки. Каждое вещество собирают в отдельный приемник. Если вещества выходят смесью - смесь собирают отдельно. Если разделяемые вещества не окрашены, ведут сбор фракций определенного объема, который зависит от размеров колонки и от степени разделения веществ (Rf). Пример: Обычно при делении 0.2 г исходной смеси собирают по 7-10 мл фракций, при делении 2-3 г - по 20-25 мл.
5. Лапка. Колонку закрепляют на штативе при помощи лапки. Важно! Металлическая лапка НЕ должна соприкасаться со стеклом, для избежания растрескивания колбы при перегонке. Для этого между колбой и лапкой помещают резиновые прокладки.

Газожидкостная хроматография

Газожидкостная хроматография основана на физико-химическом разделении анализируемых компонентов, находящихся в газовой фазе, при их прохождении вдоль нелетучей жидкости, нанесенной на твердый сорбент. Это один из наиболее перспективных методов анализа. Широкое распространение и перспективность методов ГЖХ обусловлены тем, что они позволяют разделить и количественно определить вещества в сложной смеси даже в тех случаях, когда они сходны по химическим свойствам, а температуры кипения W различаются на десятые доли градуса. Для анализа требуются очень малые количества вещества, а время определения обычно исчисляется минутами.

Разделение анализируемых веществ происходит в колонках (трубках), наполненных твердым пористым сорбентом, на который нанесена жидкая нелетучая стационарная фаза. Пары анализируемых веществ, смешанные с газом-носителем, движутся через колонку. При этом происходит многократное установление равновесия между подвижной газовой и жидкой стационарной фазами, обусловленное многократным повторением процессов растворения и испарения. Вещества, лучше растворимые в стационарной фазе, дольше удерживаются ею. Благодаря этому происходит разделение анализируемой смеси на отдельные компоненты, которые выходят из колонки отдельно и регистрируются на выходе.

Эффективность использования метода ГЖХ в каждом отдельном случае зависит от правильного выбора жидкой фазы, размера частиц и природы твердого носителя, скорости и природы газа-носителя, температуры, количества вводимой пробы, длины колонки и других факторов. Поскольку теоретический учет этих факторов не всегда возможен, эффективность анализа ГЖХ в большой степени зависит от практических знаний и опыта экспериментатора.

Поведение анализируемого вещества в колонке хроматографа можно охарактеризовать временем удерживания (fe), Т. е. временем, прошедшим от момента ввода пробы в колонку до момента появления максимума хроматографического пика этого компонента. Очевидно, что эта величина при прочих равных условиях будет зависеть от объемной скорости газа-носителя (F). Поэтому хроматографические пики принято характеризовать величиной удерживаемого объема (VR):

Удерживаемый объем зависит от размера пробы и ряда других факторов. Поэтому для расчетов применяют не простую величину Vr, а исправленную с учетом времени удерживания несорбирующегося вещества (воздух, инертный газ) - t0; мертвого объема, равного удерживаемому объему несорбирующегося вещества, - Vm, сжимаемости j; массы неподвижной фазы W; абсолютной температуры колонки T и т. д.

Довольно часто пользуются исправленным удерживаемым объемом VR, который представляет собой разность удерживаемого объема вещества и удерживаемого объема газа-носителя:

Вдоль каждой колонки существует градиент давления. Поэтому вводят поправочный коэффициент j, который учитывает сжимаемость газа в колонке:

где Pi - давление газа-носителя на входе в колонку, а Ро - давление на выходе из колонки. С учетом сжимаемости исправленный удерживаемый объем будет:

Пользуются также величиной удельного удерживаемого объема:

Эта величина эквивалентна VN при 0 С на 1 г жидкой фазы.

Относительный удерживаемый объем рассчитывают по формуле:

где индекс s относится к некоторому внутреннему стандарту, в качестве которого обычно используют нормальные алканы, а индекс х - к данному компоненту пробы.

Типичная блок-схема газожидкостного хроматографа изображена на рис. 23. Газ-носитель (гелий, азот, аргон) из баллона 1 через редуктор поступает в блок стабилизации газового потока 2, а из него - в аналитический блок 3, состоящий из термостата, колонок и ротаметра. Испытуемое вещество вводится с помощью микрошприца на стеклянную насадку, расположенную в начале колонки и обеспечивающую быстрое испарение вещества и полное смешение его с газом-носителем. Ввод пробы шприцем в колонку осуществляется через прокладку из силиконовой резины. Объем пробы в зависимости от типа детектора, прибора и условий хроматографирования колеблется в пределах от 0,1 до 10 мкл. Определяемые компоненты в смеси с газом-носителем поступают в детектор 4. Электрический сигнал от детектора поступает в усилитель 5. Усиленный сигнал записывается самопишущим потенциометром в виде хроматограммы (рис. 24) с числом пиков, соответствующим числу определяемых компонентов смеси. Количество каждого компонента можно высчитать по площади пика. Температура колонки может меняться по заданной программе с помощью блока программирования 7.

 Типичная блок-схема газожидкостного  хроматографа.

1 - баллон с газом-носителем; 2 - блок  стабилизации газового потока; 3 - аналитический блок, состоящий  из термостата, колонок и ротаметра; 4 - детектор; 5 - усилитель; 6 - самопишущий потенциометр; 7 - блок программированного изменения температуры колонки.

Газ-носитель. В качестве газа-носителя обычно применяют аргон, гелий, азот, водород, воздух. Выбор газа зависит от типа детектора и некоторых других причин. Чем больше относительная молекулярная масса газа-носителя, тем выше качество разделения компонентов анализируемой смеси (благодаря уменьшению их диффузии). Газы с меньшей молекулярной массой обеспечивают лучшую чувствительность детекторов по теплопроводности.

Наибольшая эффективность хроматографической колонки достигается при постоянной скорости потока газа-носителя. Обычно используются скорости потоков 75-100 мл/мин для колонок с внешним диаметром 6 мм и 25-50 мл/мин для колонок с внешним диаметром 3 мм. Скорость газа-носителя определяется вмонтированными в прибор ротаметрами. Для обеспечения устойчивости газового потока приборы снабжаются стабилизаторами давления. Газы для хроматографии должны быть тщательно осушены, так как вода снижает точность определения. Другие примеси практически не влияют на удерживаемые объемы, но ухудшают стабильность показаний и чувствительность детекторов.

Колонки. Применяемые в ГЖХ колонки представляют собой U-образные или свернутые в спираль металлические трубки длиной от 1 до 5 м и диаметром 3-6 мм, заполненные твердым сорбентом с нанесенной на него жидкой нелетучей фазой. Твердые носители должны быть химически инертными, иметь большую удельную поверхность (обычно 5-10 м2/г) и обладать механической и термической стойкостью. Для обеспечения максимальной эффективности колонки следует использовать носители с узким диапазоном размеров зерен. Наиболее часто рекомендуются диапазоны размеров зерен в мешках: 60/80, 80/100 или 100/120. С уменьшением размеров зерен увеличивается эффективность разделения, но возрастает сопротивление колонки и соответственно время удерживания.

Большинство носителей изготовляют из диатомитовой земли, представляющей собой разновидность водной миккроаморфной двуокиси кремния, содержащей примеси окислов металлов, и огнеупорного кирпича, свойства которого близки к свойствам диатомитовой земли. Огнеупорный кирпич имеет, как правило, более развитую поверхность и предпочтителен для работы с длинными колонками. Носители, изготовляемые на основе диатомитовой земли и огнеупорного кирпича, - это хромосорб, диатом, целатом, S-80 и др. Ряд носителей изготавливают на основе полимеров (анапорт, флуоропак, хромосорб Т, порапак и др.), а также из стекла и двуокиси кремния. В некоторых случаях адсорбент перед нанесением жидкой фазы промывают спиртовой щелочью или слабой кислотой либо обрабатывают диметилдихлорсиланом для увеличения химической инертности.

Эффективность хроматографического разделения компонентов анализируемой смеси во многом зависит от правильного выбора неподвижной фазы. Неподвижная фаза должна обладать очень низким давлением пара при рабочей температуре, так как в противном случае она будет испаряться в процессе работы колонки. Неподвижная фаза должна быть термически стойкой и оставаться в жидком состоянии во всем интервале температур, при которых работает колонка. Она должна обладать достаточной растворяющей способностью по отношению к определяемым веществам.

В большинстве случаев для приготовления колонок используют от 1 до 30% жидкой фазы от массы носителя. Колонки с содержанием жидкой фазы более 20% применяют в препаративной хроматографии. Более эффективное разделение, как правило, достигается при использовании колонок с низким содержанием жидкой фазы. Для выбора подходящей неподвижной фазы часто приходится применять метод проб и ошибок. Во многих случаях полезным оказывается правило: "подобное растворяется в подобном". В соответствии с этим такие вещества, как углеводороды, хорошо анализируются на неполярных фазах, а полярные соединения на неполярных фазах делятся плохо и выходят из колонки значительно быстрее, чем неполярные, кипящие при той же температуре (табл. 4).

Детекторы. При помощи детектора измеряют состав газа, выходящего из колонки. В настоящее время используют дифференциальные детекторы, которые позволяют измерять концентрацию компонента в данный момент. При выходе чистого газа-носителя такой детектор дает нулевой сигнал. Наибольшее распространение получили катарометр и пламенно-ионизационный детектор (ДИП). Катарометр регистрирует изменение теплопроводности газа-носителя, вызванное появлением анализируемого вещества. При работе пламенно-ионизационного детектора происходит ионизация анализируемых веществ в процессе их сгорания в пламени водорода. Образующиеся ионы рекомбинируют на электродах. Возникающий при этом ток пропорционален концентрации ионов и напряжению на электродах. Катарометр проще по устройству и удобнее в работе, но значительно менее точен, чем ионизационный детектор.

Таблица 4. Наиболее распространенные неподвижные фазы, применяемые в ГЖХ.

Жидкостная адсорбционная хроматография

В колоночной жидкостной хроматографии в качестве неподвижных фаз широкое распространение получили оксид алюминия и силикагель. Реже применяют синтетический силикат магния (флоризил), оксид магния, пористые стекла, пористые полимеры и неполярный адсорбент - активированный уголь. С появлением ВЭЖХ силикагель стал основной полярной неподвижной фазой. Таким образом, жидкостная адсорбционная хроматография (ЖАХ) на силикагеле - нормально-фазовая хроматография, в которой неподвижная фаза более полярна, чем подвижная. Для формирования ПФ в этом варианте хроматографии в качестве растворителей применяют неполярные алифатические углеводороды или дихлорметан, а в качестве модифицирующих добавок - спирты, простые ациклические и циклические эфиры, сложные эфиры, галогеналканы.

Главные преимущества силикагеля - относительная инертность, большая адсорбционная емкость, он легко поддается модификации: различные его типы значительно отличаются по размерам пор и суммарной удельной поверхности, измеренным в стандартных условиях. Поверхность силикагеля также можно модифицировать или покрыть пропитывающей средой.

В настоящее время известно более ста сортов (различных модификаций) силикагеля, а так же ряд силикагелей с химически модифицированной поверхностью, однако выбор элюента в ЖАХ играет более значимую роль, чем выбор неподвижной фазы. Меняя природу ПФ, можно в широких пределах изменять объемы удерживания и селективность разделения на одних и тех же адсорбентах.

Силикагель SiO2·хН20 имеет аморфную структуру, его внутренняя поверхность энергетически неоднородна из-за наличия нескольких типов беспорядочно распределенных силанольных ОН-групп. Кроме ОН-групп в адсорбционных процессах участвуют и поверхностные силоксановые группы ≡Si-O-Si≡. Присутствующая в силикагеле вода удерживается в нем в результате взаимодействия с поверхностными силанольными группами и за счет капиллярной конденсации.