Хроматографические методы, используемые в фармацевтическом анализе

МЕББМ «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» Фармация курсы

НУО  «КАЗАХСТАНСКО - РОССИЙСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Курс фармации

 

 

  

 

 

  

 

 

  

 

 

  

 

СРС

по дисциплине «Общие методы исследования и анализ лекартсвенных средств»

на тему: «Хроматографические методы, используемые в фармацевтическом анализе»

 

 

  

 

 

  

 

 

  

 

 

  

 

 

  

 

Выполнила: 
Савельева Д.С. 
         Факультет Фармация 
         Курс  III 
         Группа 302А 
Проверил: 
Проф. Тегисбаев Е.Т.

 

 

 

 

 

 

Алматы 2014

 

 

 

• Содержание:

 

Хроматография

• Общие черты различных видов хроматографии

Хроматографические параметры

Жидкостная хроматография

Колоночная хроматография

Газожидкостная хроматография

Жидкостно адсорбционная  хроматография

Тонкослойная хроматография

Жидкостно-жидкостная хроматография

Газовая хроматография

Газо-адсорбционная хроматография

Ионообменная хроматография

Лиганднообменная хроматография

Бумажная хроматография

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография

 

Афинная хроматография

       Применение хроматографии в фармации

Список используемой литературы

Вопросы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Хроматография

Хроматография - это метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на различном распределении веществ между двумя фазами: подвижной и неподвижной.

Подвижная фаза представляет собой поток жидкости или газа, проходящий через неподвижную фазу и переносящий вещество.

Неподвижная фаза - как правило твердое вещество с развитой поверхностью или, реже, жидкость, способные обратимо взаимодействовать с веществом. При этом чем лучше вещество сорбируется (поглощается) неподвижной фазой, тем меньше скорость его движения.

Процесс разделения основывается на различном сродстве исследуемых соединений к подвижной и неподвижной фазам: вещества движутся к "финишу" с различными скоростями и, т.о., разделяются.

• Общие черты различных видов хроматографии:

Все хроматографические методы анализа характеризуются общими чертами:

• Проведение хроматографического анализа включает стадии:
1. Введение разделяемой смеси в систему;
2. Разделение смеси одним из вида хроматографии;
3. Сбор фракций;
4. Анализ фракций.

 

Хроматографические параметры

tM - время удерживания несорбируемого соединения; tR1 и tR2 - абсолютные времена удерживания компонентов 1 и 2.

Нулевая (базовая) линия хроматограммы - линия, соответствующая нулевой концентрации анализируемых веществ в элюате.

Шум - помехи, статистические флуктуации нулевой линии хроматограммы. Уровень шума складывается из статистических флуктуации всех параметров, принимающих участие в образовании сигнала детектора.

Дрейф нулевой линии - постепенное смещение регистрируемое на хроматограмме.

Хроматографический пик - участок хроматотраммы, соответствующий площади ограниченной функцией хроматограммы в момент выхода определяемого вещества из колонки и базовой линией.

Основание пика - продолжение нулевой линии, соединяющее начало и конец хроматографического пика.

Площадь пика, S - площадь хроматограммы, заключенная между пиком и его основанием. В первом приближении

S = hWh

Высота пика, h - расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора.

Ширина пика у основания, Wb - отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика.

Ширина пика на полувысоте, Wh- отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты.

Геометрический объем колонки, Vc - внутреннее пространство пустой колонки.

Свободный объем, Vo - часть объема колонки, не занятая сорбентом.

Объем удерживания вещества, VR - объем подвижной фазы, затрачиваемой на элюирование пробы вещества. Объем удерживания определяют между точкой ввода пробы и точкой, при которой регистрируется максимум сигнала детектора.

Мертвый объем, VM - объем подвижной фазы между точкой ввода пробы и точкой ее обнаружения (кюветой детектора). Мертвый объем включает в себя свободный объем колонки, объемы устройства ввода пробы (дозатора), детектора, а также объемы коммуникаций между ними.

Приведенный объем удерживания, VR’ - объем удерживания вещества за вычетом мертвого объема:

VR' = VR - VM

Абсолютное время удерживания вещества, tR - время пребывания исследуемого вещества в хроматографе. Практически время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума соответствующего хроматографического пика.

Мертвое время, tM - время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. На практике мертвое время определяют от момента ввода пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора.

Приведенное время удерживания, tR’ - абсолютное время удерживания за вычетом мертвого времени:

tR'= tR- tM.

Эффективность хроматографической системы - количество ступеней установления равновесия между подвижной и неподвижной фазой в выбранных условиях для данного сорбата, способность к образованию узкой концентрационной зоны индивидуального компонента разделяемой смеси. Эффективность в численном выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой, эквивалентной теоретической тарелке.

Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле

N = 16(tR/Wb)2 = 5.545(tR/Wh)2,

где tR - время удерживания пика, Wb - ширина пика на его полувысоте, Wh - ширина пика у основания.

Высота, эквивалентная теоретической тарелке, H - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая как отношение длины колонки L к числу теоретических тарелок

H = L/N

Приведенное число теоретических тарелок N’ - отношение числа реально полученных теоретических тарелок на колонке данной длины к условной колонке длиной 1 м.

N=100N/L,

где L - длина колонки в см.

Приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке

H’=H/d,

где d - средний (эффективный) диаметр частиц сорбента (мкм), она также является характеристикой эффективности колонки. Вполне удовлетворительным принято считать колонки со значением H равным 3-3,5d. Очень хорошими считаются колонки с Н равным 2d.

Фактор удерживания (коэффициент емкости), k' - один из основополагающих параметров удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая удерживание вещества и равная отношению абсолютного объема удерживания к свободному объему колонки

k’ = VN/VO,

a также отношению приведенного  времени удерживания к мертвому  времени k’=tR/tM.

Селективность (относительное удерживание, αR/cm, фактор разделения, α) хроматографической системы - избирательность, способность к специфическим взаимодействиям подвижной и неподвижной фазы с молекулами сорбата, обладающими определенными структурными признаками, приводящая к разной скорости перемещения концентрационных зон индивидуальных компонентов. Количественно селективность выражается как:

• безразмерная величина, равная отношению приведенного объема (времени) удерживания определенного вещества, взятого для сравнения (стандарта) и хроматографируемого в идентичных условиях 
  αR/cm = kR/kcm = tR'/tcm' = VR'/Vcm'
• величина, которая пропорциональна отношению приведенных времен удерживания двух пиков 
  α ~ (tR2- tM) / (tR1- tM)
• безразмерная величина, характеризующая разделительную способность колонки по отношению к веществам А и Б и численно равная отношению факторов удерживания или приведенных времен (объемов) удерживания 
  αA/Б = kА’/kБ’ = tА’/tБ’ = VА’/VБ’.

Селективность колонки зависит от многих факторов, варьируя которые можно подобрать оптимальные условия хроматографии интересующей экспериментатора смеси компонентов. Исходя из химической природы разделяемых компонентов, хроматографист должен выбрать подходящий состав растворителя (подвижную фазу) и соответствующий по химической природе сорбент. Определенное влияние на селективность имеют и такие термодинамические факторы, как температура и давление в колонке, изменяющие коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами.

Коэффициент асимметрии АS - отношение двух отрезков, образуемых на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10 % от основания пика, при ее пересечении с вертикалью, опущенной из вершины пика. При этом берется отношение "тыльного" отрезка к "фронтальному"

АS = А/В

Разрешение пиков, RS - расстояние между максимумами выбранных соседних пиков, деленное на полусумму их ширин у основания (выраженных в одних и тех же единицах измерения)

RS = 2(tR2- tR1) / (Wb1+Wb2)

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.

Экстраколоночное расширение пика (ЭКР) - размывание хроматографической зоны, происходящее в инжекторе, соединительных капиллярах, в ячейке детектора.

Эффективность колонки - характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической тарелки. Эффективность колонки тем выше, чем уже ширина пика при том же времени удерживания.  Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N, тем меньше расширение первоначально узкой концентрационной зоны по мере прохождения ее через колонку, а значит, уже пик на выходе из колонки.

Колоночная хроматография

Колоночная хроматография – способ препаративного разделения смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество выходит с колонки.

• Область применения

1. Разделение смесей жидких или твердых веществ, различающихся по Rf (или tR). Пример: разделение смеси нескольких компонентов с разницей в Rf не менее ~0.15.
2. Отделение целевого вещества от не сорбирующихся примесей. Пример: Отделение целевого вещества от неорганических примесей или примесей с Rf ~0.

• Оборудование

Типичный прибор для колоночной хроматографии приведен на рисунке:

1. Элюент.

• Требования к элюенту 
1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться при его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.
2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после выделения веществ (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).
3. Элюент подбирают таким образом, чтобы на тонкослойной хроматограмме смеси (желательно на том же сорбенте), Rf продуктов различался не менее 0.15, и пятна  выходили с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы.
4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта  или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту. Пример: Rf = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример: Rf = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или  высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
• Добавление элюента. Элюент добавляется или непосредственно, или при помощи капельной (делительной) воронки. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижению разделяющей способности.