Антибиотики

Существенное  внимание при развитии продуцента в  ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.    

Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла, животный жир, а иногда минеральные масла, спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества.   

Многие  вещества (масла, жиры, спирты), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. [7]   

Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и химической очистки представлена на рисунке 1.                                           

I — приготовление посевного материала, II — инокуляторы для наращивания посевного материала, III — стерилизатор среды для большого ферментера, IV — установка для биосинтеза антибиотика:   

с — стерилизация среды в колбах, б — охлаждение и посев культуры продуцента в колбу, в — рост культуры в покое, г — рост культуры в качалке, д — инокулятор со стерильной средой, е— инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента, ж — фильтры и компрессор, з — резервуар со сжатым воздухом, и — нагрев воздуха, к — ферментер, л — рубашка для охлаждения ферментера   

Рисунок 1. Схема производства антибиотиков. [3]    

1.7 Предварительная обработка культуральной  жидкости, выделение и          химическая очистка антибиотиков    

В процессе развития микроорганизмов  образуемые ими антибиотики в  большинстве случаев почти полностью  выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в  культуральную жидкость выделяется лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.    

У ряда продуцентов антибиотик почти  полностью содержится в клетках  организма.   

В зависимости от того, где антибиотическое  вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. В случае если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют.   

Отделение нативного раствора от биомассы и  взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для процесса фильтрации применяют фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости.   

Для фильтрации небольших объемов культуральной  жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Широкое распространение в получении жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, получил способ центрифугирования. Отделение мицелия или других взвешенных частиц можно также производить в сепараторах.    

Цель  химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.   

Антибиотические вещества под влиянием жестких внешних  факторов (повышенной температуры, высокой  кислотности или щелочности и  др.) в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении  и очистке необходимо соблюдать  максимум осторожности.   

Основными методами очистки антибиотиков являются следующие.   

Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.    

Ионообменная  сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катионитами или анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик десорбируют, в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.   

Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают.

1.8После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить, т. е. удалить из полученного препарата свободную и связанную воду.

Поскольку большинство  антибиотиков в той или иной степени  термолабильны, для их высушивания  необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном  этапе промышленного получения  антибиотиков используют методы обезвоживания  препаратов.

Лиофильная сушка  антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (—8, —12°С).

Высушивание с применением  распылительной сушилки — прогрессивный  метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика  пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого  воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.

Метод взвешенного  слоя или сушка в вакуум-сушильных  шкафах применяется для высушивания  зернистых и пастообразных антибиотических  препаратов.

Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщательному  контролю: биологическому и фармакологическому.

Биологический контроль ставит задачей выяснение стерильности готового препарата. Для этого используют, как правило, два метода.

Первый — связан с инактивацией антибиотика и  высевом его в соответствующую  питательную среду. Например, биологический  контроль бензилпенициллина и полусинтетических  препаратов, полученных на его основе, производится следующим образом. В  пробирки, содержащие тиогликолевую  среду, вносят фермент пеницил-линазу в количестве, способном полностью  инактивировать пенициллин. Пробирки с пенициллиназой выдерживают 2—3 сут  при температуре 37^С для контроля стерильности фермента, затем в них  вносят раствор пенициллина. Пробирки разделяют на две группы: одну выдерживают  при 37°, а другую—при 24° в течение 5 сут. Ведут ежедневное наблюдение за возможным развитием микроорганизмов.

Второй метод  выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства  этих соединений не имеется биологических  инактиваторов их биологической  активности. Поэтому у изучаемых  препаратов выявляют наличие устойчивых к ним форм микроорганизмов, а  также определяют возможное присутствие  чувствительной микрофлоры. Для определения  возможного присутствия в таких  препаратах чувствительной к ним  микрофлоры раствор антибиотиков пропускают через мембранные фильтры с диаметром  пор не более 0,75 мк.

420

421

Необходимо подчеркнуть, что стерильность готового антибиоти- ж ка обеспечивается соблюдением  стерильных условий работы на * ' всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата.

Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной  фармакопеей СССР предъявляются  очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому  применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и на другие жизненно важные функции  организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его  острой и хронической токсичности (влияние на кровь, центральную нервную  систему, дыхание и т. д.). Показатели острой токсичности являются одним  из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально  переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (LD60), и смертельную дозу (LDioo). Только после всестороннего  и тщательного изучения препарата  он может быть рекомендован к практическому  применению.

Расфасовка и  упаковка антибиотика — следующий  этап работы. Расфасованный и упакованный  антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска  и срока годности поступает в  продажу.

2 применение

Антибиотики используются для  предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. По влиянию на бактериальные организмы различают бактерицидные (убивающие бактерий, например, за счёт разрушения их внешней мембраны) и бактериостатические (угнетающие размножение микроорганизма) антибиотики.

Выбор антибиотика  для лечения инфекционного заболевания  должен прежде всего основываться на данных о чувствительности к антибиотику  возбудителя заболевания; необходимо принять во внимание также химиотерапевтические и фармакологические свойства препарата  и особенности организма больного. Лучше всего определить чувствительность возбудителя лабораторным путем, для  чего можно использовать специальные  диски, содержащие основные антибиотики  в концентрациях, близких к тем, которые могут создаваться в  крови при введении обычных доз. Следует при этом учитывать, что  при местном введении А. в очаге  инфекции могут создаваться значительно  более высокие концентрации, и  в этих случаях антибиотик может  быть эффективен и по отношению к  микробам с более высоким уровнем  устойчивости. При трудности выделения  возбудителя, а также в неотложных случаях можно выбирать антибиотик для лечения на основании косвенных  данных, позволяющих с наибольшей вероятностью предположить тот или  иной вид возбудителя. Очень важно  перед началом лечения установить, какие А. уже вводились больному и не было ли у него при этом побочных реакций, особенно аллергических. В  сомнительных случаях можно рекомендовать  производить кожную пробу.