Антибиотики

Из  данного примера можно сделать  вывод, что биотехнология антибиотиков весьма сложное, но в тоже время необходимое производство. Технологию получения антибиотиков нужно совершенствовать, а совершенствование невозможно без изучения основных стадий получения антибиотиков, а также анализа всех процессов, происходящих на них.      

1. Технология получения антибиотиков    

1.1 Общие сведения о производстве  антибиотиков   

Успехи  антибиотической отрасли промышленности и качество выпускаемой продукции определяются уровнем основных стадий технологического процесса. Промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.   

1) Стадия биосинтеза антибиотика. Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.   

Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального  накопления, стоимости сред для культивирования  организма, в том числе стоимости  применяемых предшественников, а  также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием  продуцента антибиотического вещества.    

2) Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации. Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).    

3) Стадия выделения и очистки антибиотика. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества применяются различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются следующие: экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.   

Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1%) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах концентрация антибиотического вещества увеличивается до 20—30%. Все это требует применения различных емкостей и различных объемов используемых реагентов.   

4) Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. Особенность стадии определяется очень высокими требованиями к качеству конечного продукта. При химической очистке антибиотических веществ необходимо соблюдать высокую чистоту помещений, оборудования, проводить систематическую дезинфекцию их. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными: получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировка и упаковка должны осуществляться в асептических условиях.   

В современных условиях производства антибиотиков необходимо принимать меры к максимальному снижению себестоимости препаратов. Для этого необходимо:   

1) внедрение в производство наиболее  высокопродуктивных штаммов микроорганизмов  — продуцентов антибиотиков;   

2) создание и обеспечение самых  благоприятных условий развития  продуцента антибиотика на относительно  дешевых средах;   

3) широкое использование математических  методов планирования процесса  развития организма и электронно-вычислительной  техники с целью оптимизации  и моделирования условий его  культивирования, обеспечивающих  максимальный выход антибиотика;    

4) применение современного оборудования  на всех стадиях технологического  процесса с автоматизированными  контролирующими устройствами основных  параметров развития организма  и стадий биосинтеза антибиотика. [3]    

1.2 Стерилизация питательных сред   

Для каждого продуцента антибиотика  разрабатывается оптимальная питательная среда. В зависимости от природы используемого микроорганизма в качестве источника углерода возможно применение различных субстратов. Например, для получения пенициллина лучшим источником углерода и энергии является глюкоза и лактоза; грамицидина – глицерин и соли янтарной кислоты; стрептомицина и неомицина – глюкоза. [2] Среда должна соответствовать определенным требованиям:    

1) обеспечивать максимальное образование  антибиотика;    

2) состоять из относительно дешевых  компонентов;    

3) иметь хорошую фильтрующую способность;     

4) обеспечивать применение наиболее  экономичных приемов выделения  и очистки антибиотиков.   

Стерилизация  питательных  сред  в промышленных  условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.   

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30—60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27—30°С.   

За  время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, происходит разрушение значительного числа микроорганизмов. Хорошо известно, что для нагревания до температуры стерилизации больших объемов среды и затем ее охлаждения требуется больше времени, чем для маленьких объемов, а поэтому время, затрачиваемое на поддержание наиболее высокой стерилизующей температуры в больших объемах, может быть меньшим, чем для небольших объемов с тем же эффектом стерилизации.    

Наилучший эффект стерилизации и сохранения термолабильных веществ среды получается в том  случае, если стерилизация проводится при более высокой температуре  и за более короткое время.   

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонку, через которую пропускается острый пар. Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и происходит быстрый ее нагрев. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.   

Среда, нагретая в колонке до температуры  около 130°, поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125—130°С. Время выдержки зависит от состава среды и составляет 5—10 минут. Из выдерживателя стерильная  среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30—35°С (на выходе) и поступает в ферментер.   

Непрерывный метод стерилизации имеет ряд  преимуществ по сравнению с периодическим:   

1) при непрерывном методе стерилизации  каждый элементарный объем среды  находится при высокой температуре  короткое время;    

2) благодаря более высоким температурам  стерилизации и короткой экспозиции  деструкция компонентов питательной  среды минимальна;   

3) процесс стерилизации всего объема  питательной среды растянут во  времени, этим обеспечивается  более равномерная разгрузка  котельной;   

4) процесс легко контролируем и  управляем.    

При применении в качестве отдельных  компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима. [4]    

1.3 Подготовка посевного материала   

Подготовка  посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле  биотехнологического метода получения  антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивается на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в основном ферментере. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор. [3]    

1.4 Методы культивирования продуцентов  антибиотиков   

В современных условиях наиболее перспективным  методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.   

Можно указать четыре основные модификации  глубинного способа выращивания микроорганизмов.    

1) Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.   

2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.    

3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий.    

Освобожденный ферментер немедленно заполняется  свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.   

4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков.   

В основе этого метода лежит то, что  развитие микроорганизма происходит в  условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. [5]    

1.5 Ферментеры   

Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.    

Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами.    

Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6]   

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и  проявления им повышенной физиолого-биохимической  активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.   

Наблюдение  за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.   

В современных ферментерах контрольно-измерительная  аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.   

В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.    

Лабораторные  ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.    

Полупроизводственные  ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали.   

Производственные  ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50 и 100 м³.   

Стерилизация  полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем.    

Использование волокнистых фильтров — широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем, чем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность. [3]    

1.6 Развитие продуцента антибиотика  в ферментере    

Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент условий развития организма — продуцента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляется биологический контроль, учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата: источников углерода, азота, фосфора; внимательно следят за образованием антибиотика.