Качественные реакции на белки и аминокислоты

В две пробирки наливают по 1 мл раствора аминокислоты тирозина. В одну пробирку добавляют первую часть некипяченого экстракта картофеля. Во вторую пробирку наливают охлажденный кипяченый  экстракт. Обе пробирки ставят в  водяную баню (40°С). Время от времени  пробирки встряхивают. Через некоторое  время наблюдают, что в первой пробирке раствор постепенно становится розово-красным, потом бурым и, в  конце концов, черным. В пробирке с кипяченым экстрактом фермент  не активен из-за денатурации и  поэтому окисление тирозина происходит значительно медленнее.

 

Опыт 4. Обнаружение уреазы в соевой муке.

Уреаза гидролитически расщепляет мочевину на аммиак и углекислый газ. Реакция высокоспецифична. Фермент в значительных количествах содержится в сое.

В пробирку наливают 3 мл 5% раствора мочевины, добавляют 20 – 30 мг соевой муки и 2 капли  фенолфталеина. Пробирку оставляют  при комнатной температуре и  наблюдают за появлением розовой  окраски, что происходит вследствие смещения рН раствора в щелочную сторону  за счет образования аммиака.

За образованием аммиака также  можно наблюдать по изменению  окраски влажной красной лакмусовой бумажки, помещенной в отверстие  пробирки. Через некоторое время  бумажка синеет от выделяющегося  аммиака, который можно обнаружить и по запаху.

 Опыт 5. Обнаружение сахаразы в дрожжах.

Фермент сахараза катализирует реакцию  гидролиза сахарозы до глюкозы и  фруктозы. Большое количество этого  фермента содержится в дрожжах.

2 – 3 г дрожжей растирают в  ступке с чистым песком, добавляют  15 мл дистиллированной воды, настаивают  при перемешивании 10 мин, сначала  фильтруют через марлю, а потом  центрифугируют 5 мин (3 тыс. об/мин). Полученный центрифугат используют для проведения опыта.

В две пробирки наливают по 3 мл раствора сахаразы – экстракта из дрожжей. Одну пробирку, контрольную, кипятят  для разрушения фермента и охлаждают. В обе пробирки наливают по  3 мл раствора сахарозы и ставят в водяную  баню (40°С) на 10 – 15 минут.

 По истечении времени в  пробирки добавляют по 2 мл раствора  Фелинга, нагревают. В пробирке с активным ферментом образуется красный осадок закиси меди, поскольку в ходе гидролиза образовалась глюкоза, которая восстановила медь из Cu+²  до Cu+^1. В контрольной пробирке образование оксида не наблюдается.                       

                                      

 

Оформление работы

По каждому опыту описывается  порядок его выполнения, условия  проведения опыта, приводятся уравнения  реакции  и записываются наблюдения.

 

 

 

Лабораторная работа  № 11

Изучение свойств фермента амилазы слюны

Реактивы и оборудование: раствор I₂  в KI, 1%-ный раствор крахмала, раствор Фелинга, 1% раствор хлорида натрия, 1% раствор медного купороса, 0,1 М растворы гидрофосфата и дигидрофосфата калия, 1% раствор сахарозы, 10% раствор гидроксида натрия, пробирки,  пипетки, бюретки, индикаторная бумага, рН-метр, стеклянные трубочки, мерные цилиндры, пластинки с ячейками, стаканчики на 50 - 100 мл, воронки, водяные бани, стаканы, марля, лед, электроплитки, термометры, спиртовки, штативы.

Ферменты амилазы катализируют реакции гидролиза крахмала, относятся  к классу гидролаз. Различают несколько  типов амилаз: α-, β- амилазы, глюкоамилазы, амило-1,6 – глюкозидазы. Они катализируют гидролиз α-1,4 и α-1,6 связей в полисахаридах и олигосахаридах с образованием в качестве конечных продуктов мальтозы и глюкозы.

В процессе постепенного гидролиза  крахмала под действием амилаз происходит образование промежуточных продуктов  – декстринов разной степени сложности. За ходом гидролиза можно наблюдать  по изменению окраски с йодом. Крахмал дает синее окрашивание, растворимый крахмал – сине-фиолетовое, амилодекстрины (молекулярная масса  ≈10000) – фиолетовое, эритродекстрины (молекулярная масса 4000-6000) – от красно- бурого до красного, мальтодекстрины (молекулярная масса около 1000) не дают окрашивания с йодом точно так же, как глюкоза и мальтоза.

                  + nН₂О                             +nН₂О                                 +nН₂О

(С₆Н_1ОО₅)n  ──→ амилодекстрины  ──→    эритродекстрины──→  

   синяя                   сине-фиолетовая                    красно-бурая 

 окраска                          окраска                               окраска    

──→     мальтодекстрины  ──→   мальтоза  ──→   глюкоза

                   не окрашены                          не окрашены

Приготовление разбавленной слюны

Ополаскивают рот водой 2-3 раза, и в чистый стаканчик собирают слюны столько, чтобы при ее разведении дистиллированной водой в 3 раза получилось 30 мл раствора. Полученный препарат амилазы  фильтруют через марлю и используют для опытов.

Опыт 1.Обнаружение амилазы  в слюне

Перед тем как изучать свойства фермента амилазы, необходимо убедиться  в наличии в слюне этого фермента. С этой целью в одну пробирку наливают 5 мл раствора крахмала и  1 мл препарата амилазы. В контрольную пробирку помещают 5 мл раствора крахмала и 1 мл дистиллированной воды.

 Обе пробирки помещают в  водяную баню при 40ºС и сразу начинают проводить качественные пробы с раствором йода. Для этого на пластинку в ячейки помещают капельки раствора йода и с помощью стеклянной трубочки или пипетки вносят в них из опытных пробирок по капельке раствора. Взятие проб повторяют через 30 секунд. Наблюдают за изменением окраски. Окраска растворов в пробах из опытной пробирки  постепенно должна меняться:: сначала синяя, потом фиолетовая, далее красно-бурая, потом желтая.

Скорость реакции гидролиза  крахмала зависит от  концентрации крахмала и фермента. В случае если гидролиз идет медленно (все время  образуется синяя окраска), или, наоборот, очень быстро (окраска сразу становится желтой), необходимо опыт поставить  еще раз, изменив объемное соотношение  взятых для опыта препарата амилазы и раствора крахмала. В этом опыте важно   установить, каким должно быть это соотношение,  чтобы в течение не более 5 минут можно было наблюдать окраску всех промежуточных продуктов реакции. Наблюдать за опытом удобно, когда он идет не слишком быстро и не слишком медленно.

В контрольной пробирке, где нет  амилазы, окраска раствора все время  должна оставаться синей.

Опыт 2. Влияние температуры  на активность амилазы слюны.

При низкой температуре ферментативные реакции идут медленно. По мере повышения  температуры скорость ферментативных реакций возрастает, причем с каждым повышением на 10 градусов скорость реакции  возрастает в 2 – 3 раза ( у небиологических катализаторов  в 2 – 4 раза). При достижении некоторого оптимума дальнейшее повышение температуры  ведет к падению активности фермента и вследствие этого к снижению скорости ферментативных реакций. Объясняется это денатурацией ферментов, имеющих белковую природу. У большинства ферментов температурный оптимум лежит в пределах 40 - 60ºС.

 Сухие препараты некоторых  ферментов способны выдерживать  значительно более высокое   нагревание без заметной потери  своей активности. В растворе  же эти ферменты при кипячении  целиком теряют свою каталитическую  активность. Низкая температура  не инактивирует ферменты. В этих  условиях они лишь замедляют  или останавливают свое действие.

В 4 пробирки наливают по 2 мл раствора препарата фермента. Одну пробирку помещают в стакан со льдом, другую – в кипящую водяную баню, третью  оставляют при комнатной температуре  в штативе, а четвертую помещают в водяную баню при  40ºС. Пробирки при указанных температурах необходимо выдержать не менее 5 минут. После  этого во все пробирки (не меняя температурных условий!), очень быстро добавляют по  6 мл раствора крахмала и хорошо перемешивают. Соотношение объема раствора крахмала и препарата фермента может быть тем, которое установлено в опыте 1.

 Сразу же начинают проделывать  йодную пробу с раствором из  каждой пробирки через каждые 0,5 – 1 минуту и записывают наблюдения. По изменению окраски крахмала  с йодом судят о степени  гидролиза крахмала в каждой  пробирке. Результаты наблюдений  анализируют и делают выводы.

Оформление результатов  опыта

Результаты проведения опыта рекомендуется представить  в форме таблицы:

                                                                                                          Таблица 1

Номер пробирки	Температура,             ºС	Реакция с йодом по истечении  времени, мин
		0	1	2	3	4	5	6
1         2 3 4	0 20 40 100

Опыт 3. Влияние рН на активность амилазы слюны

Известно, что ферменты проявляют  свою максимальную активность при определенных значениях рН (оптимум рН),  и  очень чувствительны к изменению  кислотности среды, в которой  они действуют.  Изменение кислотности  среды в ту или иную сторону  от оптимума рН вызывает понижение  активности фермента, что объясняется  действием ионов водорода на ионизацию  белковой молекулы, а, следовательно, на  пространственную структуру фермента.

Готовят серию буферных растворов  с рН 4,49; 5,59; 6,98; 7,38; 8,04, используя растворы гидрофосфата и дигидрофосфата калия и бюретки.

Приготовление фосфатных  буферных смесей

                                                                                                         Таблица 2

Номер пробирки	К2 НРО4, мл	КН2РО4, мл	рН
1 2 3 4 5	0,00 0,50 6,00 8,00 9,50	10,00 9,50 4,00 2,00 0,50	4,49 5,59 6,98 7,38 8,04

Определение рН буферных смесей проводят с помощью рН-метра. Для приблизительной  оценки  рН растворов можно воспользоваться  индикаторной бумагой или прибором Алямовского. Необходимо сразу приготовить большое количество буферных растворов с таким расчетом, чтобы каждому выполняющему опыт досталось по 5 мл  каждой буферной смеси.

В пять пробирок наливают по 5 мл каждой из приготовленных буферных смесей, добавляют  по 2 мл препарата фермента амилазы  и по 5 мл раствора крахмала, тщательно  перемешивают.

После этого все пробирки помещают в водяную баню при  40ºС. Наблюдения за ходом гидролиза начинают сразу, проводя йодную пробу на пластинках с растворами из пробирок. Отмечают, в какой пробирке гидролиз крахмала идет быстрее всего. На основании полученных результатов делают вывод об оптимальных условиях гидролиза крахмала по величине рН.

Оформление результатов  опыта

Результаты проведения опыта рекомендуется представить  в форме таблицы:

                                                                                                           Таблица 3

Номер пробирки	рН	Реакция с йодом по истечении  времени, мин
		0	1	2	3	4	5	6
1 2 3 4 5	4,49 5,59 6,98 7,38 8,04

Опыт 4. Влияние активаторов  и ингибиторов на активность амилазы  слюны.

На активность ферментов  оказывают воздействие активаторы и ингибиторы. Активаторы – это  вещества, которые усиливают действие ферментов, а ингибиторы, наоборот, подавляют действие ферментов. В  данном опыте предлагается экспериментально определить, какое из двух веществ – хлорид натрия или медный купорос является активатором, а какое -  ингибитором фермента амилазы. 

В три пробирки наливают по 1 мл препарата  фермента амилазы. В первую пробирку добавляют  0,5 мл  1% раствора хлорида  натрия, во  вторую – 0,5 мл 1% раствора медного купороса, в третью – 0,5 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 3 мл раствора крахмала, перемешивают и ставят пробирки на водяную баню. Контроль ведут по реакции с йодом на пластинках сразу после начала опыта через  каждые 0,5 – 1 минуту. Полученные результаты и наблюдения записывают в тетрадь, делают соответствующие выводы.