Технология получения гормона роста

Через шесть месяцев те, кто получал препарат, увеличили  не жировую массу тела в среднем  на 8,8 %, а жировую массу снизили  на 14 %. Их кожа стала плотнее и  крепче, повысилась плотность поясничных позвонков. Эксперимент Радмена был сразу же назван выдающимся прорывом. Он вдохновил врачей и ученых всего мира на поиски возможности восполнения гормона роста при лечении старения и связанных с этим болезней.

Шведский ученый Томас  Фалькхеден в своей докторской диссертации описал состояние пациентов, у которых был удален гипофиз. Через месяц после операции у них снижался обмен веществ, уменьшался объем крови, ухудшалась функция сердца и почек. Он выдвинул гипотезу, что причиной этих разрушительных изменений было отсутствие гормона роста у этих пациентов.[6]

Существует три основных способа получения гормона роста:

1. Гомологичный. Данный метод основан на  использовании человеческого  трупа. Точнее его      гипофиз, из которого с помощью вытяжки извлекается гормон роста.  Так в самом начале производили соматропин, пока не заметили множества побочных действиий  (перенос болезней от покойного, боль в суставах и т.д.). Поэтому сейчас этот способ производства запрещен во      всем мире.
2. Синтетический.  Для этого      нужно  с помощью химического синтеза      создать фрагмент ДНК, содержащий первые 24 аминокислоты ГР.  Для  создание последующих 167 аминокислот используется информационная РНК, извлеченная из клеток гипофиза человека. Этот процесс очень трудоемок и сложен.
3. Рекомбинантный.  Для этого нужно взять штамм бактерий кишечной палочки Escherichia coli и поменять ее генотип      таким образом, чтобы она синтезировала человеческий гормон роста. Эта      технология самая новая и лучшая, потому что образованный таким образом      гормон, ближе всего к человеческому , и поэтому к нему почти не образуются      антитела. [3]

 

2. Технология получения соматропина

 

1. Штаммы-продуценты, их получение и поддержание чистоты

 

Штамм Е.coli - продуцент метионил-соматотропина человека послужил прообразом штаммов, которые в настоящее время используются фирмами Genentech Inc. и KabiVitrum для производства коммерческих препаратов гормона роста (Protropin и Soma-tonorm).

Штаммы S. cerevisiae SCR-H1 и SCR-H2 - продуценты секретируемого рекомбинантного соматотропина человека депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как S. cerevisiae ВКПМ Y-3506 и S. cerevisiae ВКПМ Y-3507 соответственно. Штаммы хранят при температуре -70°С в 20%-ном водном растворе глицерина. Стабильность заявляемых штаммов сохраняется при 20 последовательных пересевах на агаризованной среде YPD при температуре 28°С. При выращивании в колбах в жидкой неселективной среде YPD в течение 48 ч при температуре 28°С клетки штамма S. cerevisiae SCR-H1 продуцирует соматотропин человека в количестве до 100 мг/л среды, а клетки штамма SCR-H2 - в количестве до 150 мг/л среды. [7]

 

2. Технология получения соматропина

 

Весь технологический  цикл состоит из пяти функционально  различных этапов:

 

1) ферментация;

 

2) первичная очистка белка;

 

3) хроматографическая очистка;

 

4) изготовление лекарственной  формы;

 

5) анализ качества субстанции  и лекарственной формы соматогена.

 

Важной особенностью технологического процесса является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка.

 

Неотъемлемой составной  частью каждого технологического цикла  промышленного производства является проведение сложного комплекса анализов качества продукта. В основе объема и номенклатуры этих анализов лежат  соответствующие рекомендации ВОЗ. [8]

 

3. Методы выделения, очистки и фасовки конечного продукта

 

После окончания ферментации  образовавшийся продукт необходимо отделить от среды и очистить. Обычно содержимое ферментера сначала разделяют  на жидкий компонент и твердый  компонент, содержащий клетки. Это делается, как правило, с помощью фильтрации или центрифугирования. Нужный продукт  может нахолиться либо в жидкой фазе в растворенном состоянии, либо внутри клеток. Имеется целый ряд биохимических методов разделения и очистки, таких как высушивание, хроматография, экстракция растворителем и дистилляция. Важность процессов дальнейшей переработки наглядно демонстрирует тот факт, что на заводе компании Eli Lilly, производящем инсулин, этим занимается около 90% из 200 человек персонала. Методы, которые используются на стадиях дальнейшей переработки в производстве пенициллина и микопротеина, рассматриваются в нашей статье. Продукция медицинского назначения Одним из наиболее успешных и экономически выгодных направлений микробиологической промышленности является производство медицинских препаратов. Обычно они эффективны в относительно малых количествах и имеют довольно высокую стоимость. Получение их в ферментерах позволяет снизить себестоимость. В последующих разделах рассматриваются наиболее эффективные методы получения медикаментов.

Продуценты рекомбинантного  гормона роста человека синтезируют  его внутриклеточно или секретируют в среду.

Известны многочисленные способы выделения и очистки  гормона роста человека, продуцируемого рекомбинантными штаммами микроорганизмов  внутриклеточно. В частности, бактерии Escherichia coli образуют его в клетках в виде телец включения (RU 2099348, US 4511503, JP 4112900, CN 101665788), а другие организмы накапливают в периплазме или цитоплазме (US 6436674, EP 0974654, EP 0321940, WO 9419474).

Однако для технологии получения целевого белка использование  микроорганизмов-продуцентов, секретирующих  гормон предпочтительнее, так как  требует меньше трудозатрат.

Способ выделения секретируемого рекомбинантного соматотропина  разработан для бактерий Bacillus subtilis (Franchi E, Maisano 1991; Teresa M, Ribela 2000), а для дрожжей Pichia pastoris предложен способ очистки секретируемого рекомбинантного полигистидин-содержащего соматотропина (Calik P, Orman 2008).

Известен способ выделения  из культуральной жидкости и очистки рекомбинантного соматотропина, секретируемого дрожжами Pichia pastoris (WO 2010134084), включающий двухстадийную ионообменную хроматографию на сорбентах типа SP-Sepharose FF и Toyopearl SuperQ, гидрофобную хроматографию на Toyopearl Super Butyl, фильтрацию на Сефадексе G-25 и анионную хроматографию на Toyopearl SuperQ. Суммарный выход составляет 16,8%, а чистота полученного белка - 97,8% (по данным офВЭЖХ на С4).

Способ в общем виде

Используют штамм дрожжей S.cerevisiae, секретирующий рекомбинантный гормон роста человека в процессе ферментации в подходящих условиях. Культуральную жидкость, полученную в результате процесса ферментации, освобождают от биомассы и используют для выделения целевого белка.

Выделение целевого белка

Вариант А

Осаждение целевого белка  осуществляют путем подкисления  освобожденной от биомассы культуральной жидкости до рН 2,9-4,0. Осадок отделяют центрифугированием при 20 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Вариант В

Осаждение целевого белка  осуществляют путем добавления к  освобожденной от биомассы культуральной жидкости раствора полиэтиленгликоля 3000-6000 Да до конечной концентрации 12-25%. Осадок отделяют центрифугированием при 20 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Предварительная очистка

Вариант 1

Осадок, полученный по варианту А или варианту В растворяют в 50 мМ буфере Трис-HCl (pH 7,3), содержащем 0,025%-ный детергент Твин 20 (далее Буфер A), и доводят pH этого раствора до значения 5,6. Затем повторно центрифугируют при 20 тыс. об/мин в течение 30 мин для дополнительного осветления.

Очистку целевого белка осуществляют методом анионообменной хроматографии  при pH 5,6. Для этого полученный раствор наносят на колонку с Q-Сефарозой (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером pH 5,6, содержащим 0,025%-ный детергент Твин 20, собирают фракцию, не адсорбировавшуюся на колонке, и доводят pH до 7,4-8,0. Выход целевого белка, который здесь и далее определяют методом офВЭЖХ на С18 (KR 100274191), составляет до 65% от взятого на осаждение.

Вариант 2

Осадок, полученный по варианту A или варианту B, растворяют в буфере 10 мМ Трис-HCl (pH 7,3), содержащем 0,025%-ный детергент Твин 20 (далее Буфер B).

Очистку целевого белка осуществляют методом диафильтрации. Для этого к раствору целевого белка прибавляют равный объем 0,4 М раствора хлористого натрия в 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4 и концентрируют в 2 раза, используя мембрану с порогом отсечения 10 кДа. Затем в режиме диафильтрации против 10 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4, снижают концентрацию соли в 8 раз. Выход целевого белка до 85% от взятого на осаждение.

Основная очистка целевого белка

Основную очистку целевого белка осуществляют в два этапа.

ЭТАП 1

Для основной очистки целевого белка, подвергнутого предварительной  очистке по варианту 1 или 2, используют метод анионообменной хроматографии  при pH не менее 7,3. Для этого раствор целевого белка наносят на колонку с Q-Сефарозой, уравновешенную буфером В. Колонку промывают исходным буфером, затем 70 мМ раствором хлористого натрия в буфере В и элюируют целевой белок 0,25 М раствором хлористого натрия в этом же буфере. Выход целевого белка на этой стадии составляет до 90% для каждого из вариантов.

ЭТАП 2

Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации. Для этого раствор целевого белка, полученный на ЭТАПЕ 1, подвергают гель-фильтрации на колонке Супердекс G75 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция), уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М хлористый натрий. Выход целевого белка в мажорной фракции на этой стадии составляет до 82% для любого из вариантов.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки достигает 60%.

Пример 1. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 1) рекомбинантного  гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

После окончания процесса ферментации клетки дрожжей отделяют центрифугированием (30 мин при 10 об/мин). К 100 мл освобожденной от биомассы культуральной жидкости (супернатанта), добавляют 20 мл 1 M лимонной кислоты до достижения рН 2,9 и выдерживают 1 ч при 5°С. Осадок отделяют центрифугированием (30 мин при 20 об/мин), растворяют при 5°С в 100 мл Буфера A и доводят до pH 5,6 с помощью 0,1 M раствора едкого натра. Затем повторно центрифугируют в тех же условиях для дополнительного осветления раствора.

Полученный раствор подвергают предварительной очистке. Для этого  его наносят на колонку с Q-Сефарозой (10 мл), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером pH 5,6, содержащим 0,025%-ный детергент Твин 20. Собирают фракцию, не адсорбировавшуюся на колонке, и доводят pH до 7,4. Выход целевого белка составляет 58% от взятого на осаждение.

Основную очистку целевого белка осуществляют методом анионообменной хроматографии при pH 7,3 (ЭТАП 1). Для этого раствор белка наносят на колонку с Q-Сефарозой, уравновешенную Буфером В. Колонку промывают исходным буфером, затем 70 мМ раствором хлористого натрия в буфере В и элюируют целевой белок 0,25 M раствором хлористого натрия в этом же буфере. Выход целевого белка на этой стадии составляет 85%.

Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации (ЭТАП 2). Для этого элюат, полученный после анионообменной хроматографии, подвергают гель-фильтрации на колонке Супердекс G75, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 M хлористый натрий. Выход целевого белка на этой стадии составляет 82%.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки составляет 40%.

Пример 2. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 1) рекомбинантного  гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 1, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S.cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 38%.

Пример 3. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 2) рекомбинантного  гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

Осаждение целевого белка  осуществляют как в примере 1, но образовавшийся осадок растворяют в 100 мл буфера A. Предварительную очистку  осуществляют методом диафильтрации. Для этого к раствору целевого белка прибавляют равный объем 0,4 M раствора хлористого натрия в 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4 и концентрируют в 2 раза в ячейке Amicon (MIllipore, США) на мембране DIAFLO РМ 10 (Amicon Corporation, США). Затем в режиме диафильтрации против 10 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4, снижают концентрацию соли в 8 раз. Выход целевого белка в концентрате составляет 75% от взятого на осаждение. Далее осуществляют основную очистку целевого белка методом анионообменной хроматографии как описано в примере 1. Выход целевого белка на этой стадии составляет 87%. Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации, как описано в примере 1. Выход целевого белка на этой стадии составляет 82%.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки составляет 54%.

Пример 4. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 2) рекомбинантного  гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 3, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S.cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 57%.

Пример 5. Выделение (вариант B) и очистка (вариант 1) рекомбинантного  гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

После окончания процесса ферментации клетки дрожжей отделяют центрифугированием (30 мин при 12 об/мин). Осаждение целевого белка осуществляют путем добавления раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) 3000 до конечной концентрации 25%. Для этого к 100 мл супернатанта добавляют 100 мл 50%-ного раствора ПЭГ 3000 и выдерживают 30 мин при 5°С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (30 мин при 20 об/мин) и растворяют в 100 мл буфера А. Дальнейшую очистку осуществляют как в примере 1.