Технология получение ГМО

Для клонирования ДНК CaMV в Е. coli используют плазмидные векторы Е. coli, например, pBR 322. После обработки соответствующими рестриктазами ДНК CaMV и pBR 322 и ли-гирования образуется гибридная плазмида, способная к амплификации в   Е. coli.

Прямая  интеграция ДНК CaMV в геном хозяина  после инфекции не показана. Разработан методический прием — агро-инфекция, позволяющий осуществить прямое встраивание вирусной ДНК после инокуляции. Для этого геном CaMV встраивается в Т-ДНК и в ее составе интегрирует в ядерный геном различных растений.

К преимуществам  векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие: малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК; высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50 000 на клетку); наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов.

 

Применение  достижений генетической инженерии  в сельском хозяйстве сулит крупные успехи. Это производство пищевого и кормового белка, утилизация веществ, вредных для окружающей среды, создание технологий безотходного производства, получение биогаза, выведение высокопродуктивных пород животных, новых сортов растений, устойчивых к болезням, гербицидам, насекомым, стрессовым воздействиям и т

 

д. Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Клонирование  фрагментов ДНК — основа генетической инженерии. Что же представляет собой генетическая инженерия? Академик А.А. Баев определяет генетическую инженерию, как: «Конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе — создание искусственных генетических программ». Несколько иное определение дает профессор Э.С. Пирузян: «Генетическую инженерию составляет система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК». По сути эти определения не отличаются друг от друга. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, а следовательно, и биохимические, а затем и физиологические свойства

Цель  прикладной генетической инженерии  заключается в конструировании  таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Для решения  такой задачи необходимо создать  методики, позволяющие вырезать из молекул ДНК желаемые фрагменты, модифицировать их должным образом, реконструировать в одно целое и, наконец, размножить в большом числе копий (клонировать). Особенно впечатляет то, что, используя такие рекомбинантные ДНК, можно синтезировать молекулы РНК, а затем молекулы белка нужного размера и конфигурации, т. е. добиться выражения экспрессии гена, перемещенного из одного генетического окружения в другое.

Все эти  процедуры стали возможны вследствие становления технологии рекомбинантных ДНК, где главный экспериментальный прием заключается в клонировании генов. Именно клонирование более, чем какой-либо другой фактор, изменило весь облик биологии.

Возникновение генетической инженерии связано, прежде всего, с развитием молекулярной биологии

Выделение генов

Выделение генов — один из главных этапов в генетической инженерии. Успех  на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит прежде всего от следующих  факторов: насколько изучен данный ген и его положение в геноме донора; от разработки методов выделения мРНК данного гена и методов обнаружения функциональной активности продукта данного гена; существования объектов, в которых данный ген находится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества его мРНК, которые можно использовать для получения ДНК этого гена путем обратной транскрипции. В принципе существуют два основных пути получения гена: либо ген синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту рекомбинантную ДНК, которая содержит нужный ген.

Синтез  комплементарной ДНК (кДНК). Осуществление  первого пути стало возможным  вследствие открытия фермента—обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен из некоторых РНК содержащих онкогенных вирусов. Фермент осуществляет РНК направляемый синтез ДНК, т. е. на молекуле РНК, как на матрице, синтезируется комплементарная цепь ДНК. Отсюда и название фермента — он катализирует реакцию, обратную первому этапу экспрессии гена — транскрипции.

редположим, что нам удалось выделить гомогенный препарат мРНК, специфичной для определенного гена. В некото-174 рых случаях, когда эта мРНК составляет существенную часть тотальной мРНК, это удается. Эукариотические мРНК, как правило, содержат на своем 3’-конце последовательность, состоящую из остатков аденина — поли (А) последовательность. Для начала реакции ферменту нужна затравка в виде небольшого отрезка двуцепочеч-ной ДНК. Если смешать короткие  олигонуклеотиды, состоящие из остатка тимина (олиго-дТ), они будут гибридизоваться с поли(А) последовательностью, и такой дуплекс будет служить затравкой для начала ферментативной реакции. В результате образуется гибридная РНК—ДНК.молекула, причем на конце у нее будет короткий отрезок двуцепочечной ДНК — шпилька. Она может служить затравкой для синтеза второй цепи ДНК, который осуществляет фермент ДНК.полимераза I (рис. 3.10). С помощью эндонуклеазы SI, которая специфически гидролизует одноцепочечные участки ДНК, шпильку можно расщепить. В результате получится двуцепочечная молекула ДНК с одной из нитей комплементарной мРНК

 

кую ДНК. называют кДНК, и она соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула мРНК.

К полученной кДНК пристраивают липкие концы (см. рис. 3.4) и встраивают в плазмиду, например pBR322. Рекомбинантную ДНК вводят в Е. coll, где кДНК размножается. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормон роста, интерферон, глобин, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков, производство которых уже налажено микробиологической промышленностью.

Для того чтобы убедиться, что получен  именно тот ген, который требовался, существует несколько приемов. Если известна последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то, определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК одним из методов секвенирования (см. рис. 3.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок. Иногда применяют метод ДНК — РНК, гибридизации. Это возможно в том случае, если выделена индивидуальная мРНК (рис. 3.11).

 

 

Молекулы кДНК подвергают денатурации (при этом нити ДНК расходятся) и смешивают с избытком мРНК. В условиях

ренатурации (это процесс, обратный денатурации, при котором происходит восстановление двойной спирали, причем последняя может образоваться как из двух цепей ДНК, так и из цепи ДНК и комплементарной ей цепи РНК) будет происходить образование гибридных ДНК—РНК.молекул. С помощью эндонуклеазы SI можно убедиться в их полной комплементарности, а значит, и в том, что получен именно тот ген. Если ДНК не полностью комплементарна РНК, то в гибридной молекуле будут одноцепочечные неспаренные участки, которые будут гидролизованы эндонуклеазой SI. Более простой вариант этого метода состоит в том, что в реакции гибридизации участвует суммарная, а не индивидуальная мРНК. В результате гибридизации с кДНК индивидуальная мРНК окажется в составе гибридных молекул. Тогда эта мРНК не сможет направлять синтез полипептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе, и по отсутствию сопутствующей белковой полосы после разделения электрофорезом можно убедиться в соответствии гена мРНК.

Если  кДНК в составе векторной молекулы способна к экспрессии, т. е. на ней синтезируется мРНК, а затем белок, то ген можно идентифицировать по его продукту с помощью специфического иммунохимического метода обнаружения белка

Таким образом, используя один из этих методов  или их комбинацию, можно убедительно доказать, что получен именно нужный ген.

Мы рассмотрели  случай, когда удалось выделить индивидуальную мРНК. Это возможно, если ген избирательно активен в определенных клетках и тканях. В этом случае реакцию обратной транскрипции проводят со смешанной популяцией мРНК и в результате получают кДНК, представляющую смесь обратных транскриптов со всех типов мРНК.

Создание  банка кДНК. Теперь задача сводится к выбору из популяции молекул кДНК тех обратных транскриптов, которые представляют искомый ген. Чаще всего в этом случае прибегают к методу создания банка кДНК. Для этого с помощью линкеров молекулы кДНК сшивают с векторными молекулами и трансформируют ими бактериальные клетки. Причем опыт строится таким образом, что каждая бактериальная клетка получает только одну рекомбинантную плазмиду. В результате каждая бактериальная колония будет содержать только один вид кДНК. Далее отбирают единичные колонии и выращивают из них большие гомогенные культуры. Из клеток выделяют плазмиды, имеющие вид вставок кДНК

Плазмидную  ДНК денатурируют (при этом нити ДНК расходятся), и денатурированную ДНК необратимо связывают (иммобилизуют) с нитро-целлюлозными фильтрами. Через фильтр пропускают исходную смесь мРНК, и те молекулы мРНК, которые комплементарны данной кДНК, в результате ренатурации связываются с фильтром. Таким образом, из смеси молекул мРНК можно выделить любую их фракцию (рис. 3.12).

 

Связавшуюся с фильтром мРНК можно элюировать (смыть) с фильтра и добавить к  бесклеточной системе трансляции. Если при этом будет синтезироваться  нужный белок, значит, данный бактериальный клон содержит в своих плазмидах искомый ген. Следует отметить, что чем представительней в популяции молекул мРНК транскрипты с искомого гена, тем легче его выделить описанным выше методом.

Другой  прием — иммунный скрининг колоний, т. е. поиски клона, который синтезирует нужный белок с помощью радиоактивных антител к нему. Этот метод осуществим в том случае, когда ген экспрессируется в составе рекомбинантной плазмиды.

Выбор нужного гена из клонотеки — второй из наиболее распространенных способов получения гена. В этом случае задача исследователя сводится к поиску среди миллионов бактерий тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном

В настоящее  время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты или белка, имеющую сродство к самому гену или его продукту, соответственно.

Индивидуальная  радиоактивно меченая мРНК служит хорошим зондом для выявления бактериальных колоний, несущих искомый ген. Однако, как мы уже отмечали, индивидуальную мРНК в чистом виде удается выделить в ограниченном числе 178 случаев, как правило, в специализированных клетках, где данная мРНК синтезируется в значительных количествах. Например, в предшественниках эритроцитов больше половины всей мРНК представлено глобиновой мРНК.

В других случаях для выделения зонда  прибегают к созданию банка кДНК, кодирующую данный белок, даже в условиях тысячекратного избытка других молекул мРНК, присутствующих в той же клетке.

Иногда продукт (а значит, и мРНК) искомого гена присутствует в клетке в столь мизерном количестве, что получить индивидуальную РНК не удается. Тогда можно выделить небольшое количество чистого белка и определить аминокислотную

оследовательность некоторой его части (обычно достаточно знания участка белковой молекулы длиной 5—6 аминокислотных остатков). По известной аминокислотной последовательности можно, установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК, который кодирует данную аминокислотную последовательность. Затем из отдельных радиоактивно меченых нуклеотидов химически синтезируют олигонуклеотиды длиной не менее 16 звеньев, один из которых полностью комплементарен участку искомого гена. Такие нуклеотиды и являются пробами для поисков нужных клонов к ДНК.

После того как радиоактивный зонд получен, проводят сканирование геномной библиотеки или библиотеки кДНК, которое заключается в идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду. На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист нитроцеллюлозы; на него переходит часть бактерий с каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате и на чашке, и на фильтре колонии распределены одинаково. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК нитроцеллюлозный фильтр обрабатывают NaOH, после чего прогревают его в вакуумной печи

В результате денатурированная ДНК прочно связывается  с нитроцеллюлозой. Затем целлюлозу  помещают в раствор, содержащий меченую  кДНК или мРНК или синтетический олигонуклеотид. В условиях гибридизации метка связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Фильтр отмывают от несвязавшихся молекул и проводят радиоавтографию, которая и выявляет колонии, содержащие метку. Эти колонии идентифицируют на чашке Петри, отбирают и размножают.

Возможность выделения чистого белка позволяет  осуществить и другой подход, основанный на получении антител против белка, ген которого требуется клонировать. При использовании векторов на основе бактериофагов бактерии, зараженные фагом, содержащим искомый ген, в небольшом количестве синтезируют кодируемый им белок.

 

Поэтому библиотеку фагов можно просмотреть, используя препарат соответствующих антител, которые связываются с белком и тем самым позволяют идентифицировать клон с нужным геном. Скриннинг библиотеки осуществляется так же, как показано на рис. 3.13, с той разницей, что вместо меченой мРНК используются меченые антитела, которые также можно идентифицировать с помощью радиоавтографии