Технология получение ГМО

Итак, процедуры  генетической инженерии сводят-ся к  тому, что из набора фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирают гибридную  структуру, которую

затем вводят в клетку. Введенная  генетическая инфор-мация экспрессируется, что приводит к синтезу нового продукта. Таким образом, вводя в клетку новую генети-ческую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить измененный организм.

 

Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тка-ней с получением нормальных, фертильных (способ-ных завязывать семена) растений (рис. 1). Это свойство (тотипотентность) открывает для молекулярных биоло-гов большие возможности в изучении функционирова-ния генов, введенных в растения, а также используется в селекции растений. Для конструирования растений необходимо решить следующие задачи: выделить кон-кретный ген, разработать методы, обеспечивающие включение его в наследственный аппарат растительной клетки, регенерировать из единичных клеток нормаль-ное растение с измененным генотипом. Таким образом, методология генетической инженерии в отношении растений направлена на коренное изменение методов традиционной селекции, с тем чтобы желаемые при-знаки растений можно было получать путем прямого введения в них соответствующих генов вместо длитель-ной работы по скрещиваниям

 

Формальной датой рождения генетической инжене-рии растений является полученное с помощью Ti-плаз-мидного вектора первое в мире химерное растение сан-бин (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower + been). Это было первым ощутимым, хотя, быть может, и несовершенным свидетельством того, что в отношении растений генетическая инженерия сможет оправдать надежды специалистов в области мо-лекулярной генетики, биологии и селекции

 

КОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ РАСТЕНИЙ

 

В группе почвенных  бактерий, известных под общим  названием Agrobacteria, есть несколько видов, которые могут заражать растения и вызывать образование опу-холей, называемых корончатыми галлами, состоящи-ми из недифференцированной опухолевой ткани, рас-тущей в месте заражения. Клетки корончатых галлов во многих отношениях напоминают раковые клетки жи-вотных. Они приобретают способность к неограничен-ному, нерегулируемому росту. Когда клетки корончатых галлов культивируют in vitro, они растут при отсутствии специальных гормонов, которые необходимы при куль-тивировании нормальных растительных клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохранять эти свойства (трансформированный фенотип), даже если убить бактерии антибиотиками. Изучение индук-

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ  РАСТЕНИЙ: Ti-ПЛАЗМИДЫ

 

В A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плаз-мида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA), которая составляет 12–22 тыс. пар оснований и встра-ивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов – произ-водных аминокислот, которые используются бактери-ей как источник углерода, азота и энергии.

 

Кроме Т-ДНК  в Ti-плазмиде содержатся vir-об-ласть, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос  при бактериальной конъюгации (см. рис. 2) [2]. Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддер-жание трансформированного состояния клеток корон-чатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Все полученные мутации Ti-плазмид разделяют на три основных класса. Мутан-ты первого класса не индуцируют синтез опинов, но вызывают образование корончатых галлов. Мутанты второго класса утрачивают способность индуцировать развитие опухолей. Мутанты третьего класса стимули-руют аномальную дифференцировку нормальных кле-ток, например избыточный рост корней или побегов. Эти генетические исследования показали, что ДНК

 

 

Agrobacterium

Т-ДНК

 

vir

	ori
tra	Опухоль
	(корончатый  галл)

 

Ti-плазмида

 

Интегрированная Т-ДНК

 

Рис. 2. Agrobacterium tumefaciens вызывает обра-зование корончатых галлов (опухолей). Опухолеоб-разующим агентом является Ti-плазмида, содержа-щая область Т-ДНК (трансформирующая ДНК), ко-торая интегрируется в растительный геном; vir-область, включающую гены, продукты которых обеспечивают вырезание и перенос Т-ДНК в расти-тельную клетку; tra-область, где локализованы гены, контролирующие конъюгацию бактерий, и ori-об-ласть, содержащую гены, продукты которых обеспе-чивают репликацию Ti-плазмиды

 

Ti-плазмид содержит  гены, которые контролируют развитие  опухолей, синтез опинов [1–4]. Поскольку  у растений с мутантными Ti-плазмидами второго и тре-тьего классов с помощью фитогормонов можно стиму-лировать опухолеобразование, было предположено, что полученные мутации затрагивают гормональный мета-болизм [2, 4, 5].

 

КАКИЕ ГЕНЫ ЛОКАЛИЗОВАНЫ В  Т-ДНК

 

В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фито-гормонов. Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая переводит триптофан в индо-лилацетамид. Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превраща-ющую индолилацетамид в гормон растений ауксин – индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная дея-тельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появле-ние в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к измене-нию количества ауксина в клетках растения. Изопенте-нилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализирует ранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Ге-ны iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток [1, 2, 4, 5]. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лак-тата, который является продуктом превращения аукси-на. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к ци-токинину и сохраняет клетки в недифференцирован-ном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять ге-нов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген коди-рует фермент, катализирующий синтез опинов.

 

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ  АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

 

Процесс трансформации  можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки расте-ния, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК (рис. 3).

 

Индукция начальных этапов трансформации  мо-жет происходить только в месте  раневого повреждения растения, где  выделяются низкомолекулярные феноль-ные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где об-разуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интегра-ции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют

продукты генов, локализованных в vir-области. Вос-приятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и из-меняет способность VirA отвечать на фенольные соеди-нения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды про-низывает внутреннюю мембрану бактериальной клет-ки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG. Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин – боль-ной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

 

Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них  является двухкомпонентной эндонуклеазой. Об-ласть Т-ДНК окружена одинаковыми  повторами дли-ной 25 пар оснований. Эти последовательности явля-

ются сайтами  узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей  точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществ-ляется за 30 мин [4].

 

Внедрение Т-ДНК  в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа  нуклеотидных последовательностей  в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и на-ружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК ста-новится обычной частью генома растения [4]. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-поли-меразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют осо-бенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном прост-ранстве и использует растительные клетки со встроен-ной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины – ис-точник азота и углерода.

 

ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА

 

Т-ДНК Ti-плазмид  обладает двумя свойствами, делаю-щими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформиру-ют клетки практически всех двудольных растений. Из-вестно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доми-нантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрес-сии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены [2, 3].

 

Простейший способ введения Т-ДНК  в клетки рас-тения состоит в  том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti-плазмиды сущест-венно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход (рис. 4) [1]. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандарт-ных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий – Escherichia coli. E. сoli содержит плазмиду

 

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ti-ПЛАЗМИД

 

Еще несколько  лет назад ученые задавали вопрос, мож-но ли создать сорта, сбалансированные по составу ами-нокислот, устойчивые к холоду, засухе, не поражаемые вредителями. Сегодня можно с уверенностью утверж-дать, что такие трансгенные растения уже вышли в по-ле [6]. По литературным данным, к 1997 году в 30 стра-нах мира проведено более 3 тыс. полевых испытаний. В этих экспериментах использовали трансгенные расте-ния 40 различных видов, относящихся к разным се-мействам, включая злаки [6]. После успешных экс-периментов появились опасения о возможном вреде генетической инженерии для природы и человечества. Однако уже более чем за четверть века своего сущест-вования генетическая инженерия не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Главное, в любых экспери-ментах по генной инженерии следует соблюдать разра-ботанные правила.

 

Наиболее остро  стоит вопрос о получении расте-ний, устойчивых к вредителям сельского  хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. В арсенале генной инже-нерии растений есть много приемов, позволяющих по-лучить трансгенные растения, устойчивые к насекомым. Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, который, по-падая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндоток-син) приводит к их гибели. На рис. 5 приведена схема конструирования вектора и получения трансгенных растений хлопка, которые приобретают признак устой-чивости к насекомым. В настоящее время уже синтези-рован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обла-дают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами “Monsanto”, “Ciba Seeds” и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании еще не закончены [6].

 

Известно, что  растения, так же как и животные, способны вырабатывать иммунитет. Этим замечатель-ным свойством обладают только устойчивые растения, у которых  при атаке патогенов сильно меняется метабо-лизм. Например, у устойчивых растений накапливают-ся такие химические соединения, как перекись водоро-да (Н₂О₂), салициловая кислота (SA), фитоалексины (соединения, выполняющие защитную функцию в рас-тении). Повышенное содержание этих соединений

способствует  противостоянию растения в борьбе с  па-тогенами. Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бак-териальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспо-собны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген H₂O₂ может быть перспективным для создания устойчивых транс-генных растений.