Иммунодефициты – принцип диагностики и коррекции

1. Иммунодефициты – принцип диагностики и коррекции

Система иммунитета, как и другие жизненно важные системы, обеспечивает постоянство внутренней среды организма, его антигенный гомеостаз. Изменения в деятельности этой системы сопровождаются неадекватными реакциями на антигенный раздражитель.

К нашему времени все разнообразие патологии иммунной системы подразделяют на:

иммунодефицит – состояние недостаточности иммунного ответа на антигенную нагрузку;

аллергическое состояние – сверхсильный ответ сенсибилизированного организма на антиген;

аутоиммунное состояние – образование антител к собственным тканевым структурам с последующими морфологическими и функциональными расстройствами.

Эти иммунопатологические состояния, их переходные формы тем или иным образом включают в себя синдром иммунодефицита. Поэтому целесообразно говорить о синдроме иммунодефицита в общих рамках иммунопатологии животных.

Иммунодефицит (иммунодефицитное состояние, иммунологическая недостаточность) обусловлен выпадением одного или нескольких специфических компонентов иммунного ответа или взаимодействующих с ним неспецифических факторов защиты (фагоцитоз, система комплемента и др.). Изменения в системе иммунитета могут возникать на ранних этапах созревания, дифференцировки, функциональной активности участвующих в иммунном ответе клеток под влиянием мутагенов, цитостатиков, канцерогенов.

Иммунодефицит препятствует сохранению антигенного постоянства и целостности организма, так как при этом нарушается функции распознавания и контроля со стороны иммунной системы. Вид и степень проявления иммунодефицита зависит от того, какое звено иммунной системы нарушено и на какой ступени онтогенетического развития оно произошло. Различают

первичный, в большинстве случаев генетически детерминированный иммунодефицит, проявляющийся в раннем постнатальном периоде;

вторичный, возникающий в результате действия (иммунодепрессии) на организм неблагоприятных факторов внешней среды.

Иммунологические методы, используемые в экспериментальных исследованиях и клинической практике, достаточно разнообразны. С их помощью можно определять иммунный статус животных в норме и при патологии, осуществлять контроль за восстановлением иммунологической компетентности организма в процессе лечения методами иммунотерапии. Для определения первичного или вторичного иммунодефицита необходимо использовать лабораторные методы, которые позволяют определить количество и функциональную активность Т-, В-клеток и нейтрофилов. Кроме того, проводится количественное определение компонентов комплемента в сыворотке крови для установления их роли в иммунной дисфункции. При этом, выбор методов и рекомендаций по их практическому применению представляет определенную проблему, поскольку многие из них не являются рутинными в ветеринарной клинической практике и используются только в научно-исследовательских лабораториях или находятся на стадии разработок. Тем не менее, некоторые методы могут служить важным инструментом распознавания и понимания иммунодефицитов животных.

Некоторые лабораторные тесты, используемые для диагностики иммунодефицитов животных:

ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНЫХ ДЕФИЦИТОВ

Для определения количества или функциональной активности Т-клеток обычно используется следующие лабораторные тесты:

• дифференциальный подсчет количества лейкоцитов (лейкограмма);

• реакция гиперчувствительности замедленного типа (кожный тест);

• спонтанное розеткообразование лимфоцитов с эритроцитами барана;

• реакция бласттрансформации лимфоцитов.

Лимфопения, обнаруженная с помощью обычной лейкограммы, часто отражает уменьшение числа Т-клеток, поскольку у большинства видов животных Т-клетки составляют около 75% лимфоцитов крови. Поэтому, уменьшение общего количества лимфоцитов обычно связано с уменьшением Т-клеток.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа, определяемая с помощью кожного теста, используется у некоторых видов животных для оценки функциональной активности Т-клеток. Например, когда жеребятам с комбинированным иммунодефицитом вводят внутрикожно фитогемагглютинин, то у них не развивается положительная реакция. У собак наблюдается слабая реакция гиперчувствительности замедленного типа на введение большинства антигенов и митогенов, поэтому использование этого метода для оценки Т-клеточного дефицита у этого вида требует осторожной интерпретации результатов.

У человека 100% циркулирующих Т-клеток спонтанно образуют розетки с эритроцитами барана, поэтому этот метод является простым и достоверным методом определения Т-клеток. У животных этот метод менее достоверен, поскольку не все Т-клетки формируют розетки с эритроцитами барана (у собак только 50%).

Способность лимфоцитов in vitro отвечать на некоторые митогены клеточным делением и пролиферацией лежит в основе реакции бласттрансформации, используемой для оценки функций Т-клеток. В этом методе наиболее часто используются такие митогены как конкавалин А и фитогемагглютинин. Использование В-клеточного митогена позволяет оценивать функцию В-клеток. Различные виды животных отличаются по чувствительности к митогенам, поэтому необходим тщательный выбор митогена и схемы его применения.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ В-КЛЕТОЧНЫХ ДЕФИЦИТОВ

Для определения количества функционально активных В-клеток в крови используются:

• метод иммунофлюоресценции основан на выявлении молекул иммуноглобулина, находящихся на поверхности В-клеток с использованием конъюгированных антител к IgG, IgA, IgM соответствующего вида животных;

• метод комплементарного розеткообразования (ЕАС) основан на образовании розеток с эритроцитами барана, сенсибилизированных антителами к эритроцитам барана и комплементом. Метод недостаточно стандартизирован для рутинного использования в ветеринарии;

• метод гемолитических бляшек используется для идентификации антитело-продуцирующих В-лимфоцитов и включает химическое связывание антигена с эритроцитами барана, использование плат с кровяным агаром, куда добавляется суспензия лимфоцитов. Иммуноглобулины, секретируемые В-клетками, связываются с эритроцитами, покрытыми антигеном. При добавлении раствора, содержащего комплемент, происходит лизис сенсибилизированных эритроцитов с образованием зоны гемолиза вокруг каждой функционально активной В-клетки. Число В-клеток определяется подсчетом количества гемолитических бляшек. Вариации этого теста (прямой, непрямой, обратный) используются для идентификации таких состояний как селективная субкласс-специфическая агаммаглобулинемия (например, селективный IgA-дефицит). В этом случае используется обратный вариант метода, который включает в себя взаимодействие эритроцитов барана с анти-IgA-антителами;

• метод радиальной иммунодиффузии (РИД) для количественного определения уровня иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в сыворотке крови, по результатам которого можно судить о функциональных свойствах В-клеток. При постановке РИД моноспецифическую антисыворотку (или моноклональные антитела, обладающие преципитирующей активностью) к отдельным классам иммуноглобулинов диспергируют в агаровый гель, смесь наносят на стекло и в застывшем агаре вырезают лунки, в которые вносят испытуемые сыворотки. Антиген (IgG, IgM, IgA) диффундирует в гель, и, взаимодействуя с антителами, образует вокруг лунки кольцо преципитации, диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина в испытуемой пробе. Наряду с исследуемым материалом в другие лунки вносят раствор антигена уже известной концентрации (стандартная сыворотка). Диаметр кольца преципитации, измеренный через 24- 48 часов, сравнивают со стандартом. Количество Ig определяется по измерению диаметра кольца преципитации относительно калибровочной кривой, которая строится с использованием стандартной сыворотки. Метод обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, кроме того он прост и доступен;

• метод ракетного иммуноэлектрофореза (или электроиммунодиффузии), является модификацией РИД и может также широко применяться для количественного определения 1д в исследуемых сыворотках. Метод основан на соединении техники электрофореза и основных принципов РИД (феномен преципитации, определение концентрации антигена по стандартной кривой). При этой модификации антиген, внесенный в лунки агара, смешанного с антителами, подвергают электрофоретическому разделению до формирования пика преципитата в форме ракеты. Высота полосы преципитации пропорциональна концентрации антигена. Метод более чувствителен и менее продолжителен, чем РИД.

Кроме вышеперечисленных методов, для определения В-клеточных иммунодефицитов также используются турбидиметрический тест (основан на измерении оптической плотности смеси сыворотка - Na2SO4 для крупного рогатого скота, сыворотка - (NH4) 2SO4 для свиней, сыворотка - ZnSO4 для лошадей), реакция бласттрансформации лимфоцитов, реакция латекс-агглютинации, а также иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунный (РИА) методы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕФИЦИТОВ НЕЙТРОФИЛОВ

Наиболее распространенным методом количественного определения и характеристики морфологических дефектов нейтрофилов является лейкограмма и цитологические исследования с использованием световой и электронной микроскопии.

Для определения хемотаксической активности нейтрофилов применяют метод исследования миграции лейкоцитов с использованием камеры Бойдена. Метод основан на разделении микропористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: нейтрофилов и хемотаксических агентов (например C5a-des Arg.), которые помещаются в нижнюю камеру и создают концентрационный градиент. Помещенные в верхнюю камеру нейтрофилы мигрируют вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра. После стандартной инкубации фильтры извлекают, окрашивают и подсчитывают количество клеток. Метод довольно прост и отличается весьма высокой воспроизводимостью. Этот же принцип лежит в основе метода клеточной миграции под агарозным гелем, который используется для определения хемотаксического индекса.

Фагоцитарный индекс нейтрофилов определяется путем подсчета количества поглощенных бактерий одной клеткой после инкубации клеток пациента со стандартными препаратами St.aureus или E.coli и окраски полученных мазков. Модификацией этого теста является метод определения бактерицидной активности, при котором отмытая суспензия клеток инкубируется с бактериальной суспензией, затем смесь наносится на поверхность кровяного агара и через определенное время подсчитывается количество выросших бактериальных колоний. Оба метода требуют стандартизации для использования в каждой конкретной лаборатории и сведений об антибиотиковой терапии, которая может быть причиной недостоверных результатов или ошибок в их интерпретации.

Для определения фагоцитарной метаболической (кислородо-зависимой) активности нейтрофилов используется реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Тест включает в себя инкубацию нейтрофилов с НСТ in vitro, и по формированию нерастворимых окрашенных зерен формазана можно судить о восстановлении НСТ супероксидным радикалом, образующимся при активации фагоцитов. Отсутствие осадка свидетельствует о неспособности клеточной популяции фагоцитов к метаболизму. Очень важным при получении проб клеток крови пациентов является отсутствие гепарина в антикоагулянте, так как высокая концентрация гепарина может негативно влиять на результаты этого теста.