Биоиндикаторы

Преодоление указанных проблемм

1. Предварительная маскировка активного центра – он занимается субстратом или конкурентным ингибитором, и лишь потом ферменты пришиваются на подложку, изменяется ph и субстрат или уходит, или преобразуется
2. Spacing-группы – придерживают белок, увеличивая число степеней свободы белка, держат его у подложки, как шарик на ниточке.
3. Использование рекомбинантных белков

Также можно иммобилизовать ферменты на 3д структурах (ячеистых) из полимерного геля.

1. Но из-за жестких химических условий полимеризации матрицы снижается функциональная активность ферментов.
2. Скорость диффузии сложных молекулярных субстратов снижена. Только низкомолекулярные субстраты.
3. ЗАТО можно оптимизировать среду вокруг ферментов в ячеях.

 

Варианты сорбции на твёрдой  подложке:

1. Физическая – самый мягкий способ, за счёт взаимодействия группировок на поверхности белков и подложки связями:

 

1. Водородными
2. Ванн-дер-ваальсовыми
3. Солевыми мостиками

Применяется в модельных  экспериментах, при моделировании  биологических мембран, например. Потому что в жестких условиях белок  отвалится. Т.е. ограничения по:

1. Температуре
2. pH
3. ионной силе раствора (концентрация электролитов)
4. концентрация субстрата (в результате конформационного дыхания)

 

2. ионное  связывание – за счёт связывания меж  ионными группами подложки и белка. Чувствительна к pH и ионной силе раствора.

 

3. Ковалентное связывание – самое жёсткое. Требования:

 

1. Активный  центр не должен участвовать в  связывании с подложкой.
2. Ковалентная иммобилизации не должна приводить к полной потере ферментативной активности.
3. Можно пришить аминокислоты, которые будут как переходник связываться с подложкой.
4. Можно использовать линкеры (бифункциональные агенты) – один конец связан с белком, а другой-с подложкой. Тогда белки лежат на подушке из линкерных молекул

 

ДОКЛАД 2 - биосенсоры в военных технологиях

 

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА – снятие супрессоров (ингибиторов) с промоторов генов, их кодирующих - под действием температуры или окислительного взрыва, например.

 

Также являются частью протеасомной система, то есть конститутивными клеточными белками – разрушают старые белки, облегчают транспорт белков через мембраны, ингибируют агрегатообразование, исправляют неправильно свернутые белки. OSP – 50-60-70. Эволюционно древние и консервативные белки.

 

Цитохромы также эволюционно консервативны – ключевые системы, удачно организованные на ранних этапах эволюции.

 

Иммобилизация-способ регуляции  функциональной активности фермента.

 

КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ

ПРОБЛЕМЫ:

1. Зависимость от скорости диффузии через клеточную стенку/плазмалемму. А диффузия зависит от функционального состояния клетки.
2. Функциональная активность же может зависеть от состава подложки.
3. Неполная избирательная селективность.
4. Сорбция – по типу лиганд-рецептор. Приводит к активации вторичных мессенджеров: протеин-киназных каскадов – каскадное фосфорилирование белков.

Или кальция – ведёт  к изменению активности.

Или системы циклических  нуклеотидов – цАМФ, цГМФ.

Или системы ФИ –  фосфоинозитола.

Ведет к изменению  паттерна экспрессии генов.

Но это также ведет  к тому, что можно создавать  подложки с определенными структурными свойствами, можно управлять функциональным состоянием клетки, включая процессы дифференциации. То есть формировать  селективность биосенсора.

 

Также можно производить 3д иммобилизацию – в матриксе.

ПРОБЛЕМЫ:

1. Не только через клетку диффундирует аналит, но и через матрикс. Правда, его можно разрыхлять молекулами целлюлозы – для формирования каналов для высокомолекулярных соединений. Матрикс – гидрогели (до 96% воды от собственного веса могут удерживать). С помощью них + гормонов можно растить искусственные органы.

Пермибилизаторы – увеличивают скорость диффузии веществ в клетку – то есть увеличение её проницаемости.

С помощью специфических  ингибиторов до иммобилизации можно  заингибировать ненужные сигналинговые системы – увеличивает специфичность/селективность клеточного биосенсора.

Ковалентная иммобилизация  – с помощью глютарового альдегида.

Пример: бактерия Klipsiella fragilis. Когда её клетки живые, они метаболизируют лактозу молока в этанол. Если проводим перми билизацию этих клеток, то они эту лактозу начинают превращать в глюкозу.

Пример: подложка – углерод/электрод. На нем – бактериальные клетки. Активность будет зависеть от – подложка – пластина/напыление/покрыта маслом. Углеродная подложка ведет к снижению чувствительности клеток бактерий к этанолу. А начинают они активно использовать глюкозу. Ключевой фермент метаболизма этанола (алкоголь-дг) – находится у них на наружной клеточной мембране.

 

Также используют генномодифицированные (рекомбинантные) клетки. Чтоб решить проблему диффузии через клетку:

1. Химерные белки – под один промотор встраиваются два белка – один-мембранный, другой (нужный для рецептора) – цитоплазматический.
2. Можно встроить в нужный белок сигнальные последовательности, благодаря которым белок будет выноситься на поверхность мембраны.

 

 

Также клетки можно использовать в качестве биочипов – на повышенный уровень радиоактивности.

Можно программировать бактерии, которые будут светиться при  облучении – ген люциферазы (светлячковая система) или ген белков, обладающих флюорисценцией (GFP).

 

Можно иммобилизовывать бактерии на целлюлозе, а потом рассыпать на нефть – ремедиация окружающей среды. Можно и просто цеаллюлозу, но целлюлоза просто впитывает (потом ещё и отжать можно). А бактерии деградируют нефть.

 

Иммобилизация на границе  раздела фаз – туман – капельки жидкости в струях определенного  газа. Продукт должен быть газообразным и уноситься в среду. А субстрат должен быть растворимым.

Алостерическая регуляция фермента – ингибрование продуктом и сдвиг константы равновесия реакции в другую сторону. Преодолевается использованием вышеуказанного способа иммобилизации.

 

Биотест на качество воды –  трубочка, на ней – клетки печени, трубочка стеклянная=электрод, соединенный с регистрирующим устройством.

 

Модифицированный подобный сенсор – нанопечень. Клетки печени внутри стеклянной трубки, в неё заливается аналит, он модифицируется, а затем анализируется выходящий.

HeLa – «клетки рака этой чёрной негритянки».

Гепатоциты в культуре не делятся, они являются постмитотическими. Такими же являются нервные ткани. Также клетки сетчатки тоже не делятся.

 

Введение иммобилизованных клеток в организм

Эксперимент: брали мышей, вводили хлор, а в разрушающуюся  печень вводят следующее. Капсула с  гидрогелем+полупроницаемая мембрана/липосома – для проникновения только низкомолекулярных белков, так как иммунная система хозяина , представленная высокомолекулярными белками, будет пытаться атаковать чужеродности.

 

Печень с раком плохо  лечить, так как она все цитостатики, направленные на опухоль, детоксицирует.

 

КАЛЛУСНЫЕ КУЛЬТУРЫ

1. Цветоводство.
2. Получение метаболитов – при незнании-может снизиться производительность интересующего продукта, а при знании – наоборот, можно усилить.
3. Получение искусственного зерна. Твердый раствор альгинатов (полисахаридов водорослей)  - везикулы, в них запакованы клетки каллуса – кальцием воздействуют, чтоб везикулки получались.

Бактериородопсин – в денежных купюрах, светится в неоне.

 

ДОКЛАД ЯЗМУРАД – НАСЕКОМЫЕ  И БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ КАК БИОТЕСТЫ\СЕНСОРЫ 

ДОКЛАД – ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В КАКИХ ПРОЦЕССАХ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ И ДЛЯ ЧЕГО НУЖНО.

 

 

 

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД

АГ+АТ = слабые взаимодействия, ионный и водородные, нековалентные

 

ИФА

1. Конкурентный – для лекарств, гормонов небелковой природы (гаптенов). Их связывают с белком, тогда он вызывает синтез антител. К гаптенам относится широкий круг природных соединений: пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, антибиотики, витамины, олигосахариды и т.д. Всегда моновалентны. Оценка по количеству мест, который занял меченый кортикостероид (флюорисцентной меткой, например) из набора – обратная калибровка по флуорисценции пробы (в флуорисцентный спектрофотометр). Можно ещё фермент коньюгировать/пометить пероксидазой, туда добавляют искусственный субстрат для пероксидазы, он метаболизируется, формируется окрашенный продукт – в обычный СЭФ. Менее чувствителен, чем сендвич-анализ.
2. Сэндвич-анализ – для поливалентных антигенов
3. Непрямой – определение антител. На подложке лежат антигены.

 

Характер функционирования АТ зависит от характера подложки.

Иммобилизация на магнитных  носителях.

 

Гидролиз нуклеиновых  кислот:

РНК 37 щелочная среда

ДНК кислая среда кипящая  водяная баня (100)

 

Гидролиз – с участием воды реакции.

Выделены из гнойных повязок  нуклеиновые кислоты были впервые, Мишером.

Левене показал, что НК состоят из азотистых оснований (нанизаны на остов), сахаров и остатков фосфорной кислоты (обеспечивают основу).

1937 – рентгеноструктурный  анализ начали прикладывать к  ДНК. Вильям Астбери. Доказал, что ДНК имеет регулярную структуру. Показал периодичность в 2.7 нм. Доказал, что азотистые основания расположены параллельно друг другу и перпендикулярно главной оси.

1950 – Чаргафф. Правила А=Т, Г=Ц, А+Т=Г+У+Ц, А+У=Т+Ц.

1940е – Лайнус Полинг открыл альфа-спираль белков.

 

Связи стабилизации ДНК: стекинг-взаимодействия (между параллельными азотистыми основаниями), водородные, электростатические

Ковалентности – сахар+азотистое основание, а также сахар + фосфат

Из-за того, что двойную  спираль стабилизируют слабые взаимодействия, на неё сильно слияют:

1. Температура
2. Ионная сила раствора – в дистилляте разваливается на отдельные спирали
3. pH

гиперхромный эффект – раствор начинает поглощать больше в ультрафиолетовой области, происходит при плавлении (денатурации, распадании на две спирали) ДНК.

Скорость денатурации  ДНК зависит от её длины. Точность ренатурации также зависит от длины ДНК, если она длинная – образуются шпильки.

Раскрученная ДНК –  увеличивает вязкость раствора –  клубки вместо регулярных нитей. Так  можно контролировать ренатурацию.

А-форма – во время транскрипции образуется.

Z-форма – характерна для некоторыз энхансеров – когда активно работает хеликаза – суперспирализация.

Палиндромы приводят к  образованию комплементарных шпилек.

Клеверный

 Листик тРНК также синтезируется по принципу палиндрома.

G-ДНК – нанопровод\нанотрубка

Аптамеры – фрагменты НК,которые связываются некомплементарно. Выполняют функции специфичных рейепторов. То есть не с ДНК связываются, а с химически подходящими веществами – высоко и низкомолекулярными. На ВСЁ можно наконструировать.

Интеркалирующие вещества – вещества, встраивающиеся между азотистыми основаниями – нарушают считывание триплета, то есть являются МУТАГЕНАМИ. Оценка мутагенности – через ДНК, накрученные на нанотрубки.

 

НАНОИСКУССТВО

Технология ДНК-оригами. С  помощью скрепок (коротких 200 нуклеотидных пар), из длинных програмированых пар (около 7тыс нуклеотидных пар). Используется принцип липких концов.

Самособирающиея сетки – двумерные и трехмерные – недорого и сердито.

Применение – тканевой инженеринг – создание гибридных материалов. Протезы для костной ткани – целлюлоза + ДНК сети. Биодеградируемые и биосовместимые материалы.

Перспективы использования  нанороботов – на ютубе посмотреть.

 

Технические принципы создания ДНК-биосенсоров – как именно наносят ДНК.

 

Для избежания фальш-связывания:

1.подбор влияний, разрушающих  фальш-связывания

 

 

Сенсоры для идентификации  степени экспрессии генов – меченая  флуорисцентно мРНК комплементарно связывается с ДНК данного гена.

 

Биосенсоры на основе биолюминисценции

Люциферин-люцифераный биосенсор для определения: кислорода, атф или магния. Люцифераза иммобилиована, вносят два компонента из тех, не внесенный – определяется по степени свечения.

Рекомбинантные – к исследуемому гену пришивают ген люциферазы и добавляют все прочие компоненты – свечение.

GFP – белок зеленого свечения и другие FP: транспорт белков, работа каналов, белковых пор, сливание ядерной мембраны после деления, апаптоз. Используют флюорисцентную конфокальную микроскопию.

 

Наноматериалы и наночастицы

Живые ткани лучше проводят свет красного и инфракрасного цвета.

Экзобиосинтез наночастиц – зависит от pH, так как меняется функциональное состояние ферментов (редуктаз), синтезирующих наночастицы из ионов.

Все наночастицы индуцируют окислительный стресс.

 

ДОКЛАД:

Технология изготовления микрочипов и считывания с них информации.

 

 

СООБЩЕНИЕ:

Использование наночастиц для диагностики заболеваний – широко ли это используется – есть ли такой фармакологический препарат или это пока ещё концепт.

ДОКЛАД: