Биоиндикаторы

Биоиндикаторы  - вид, группа видов или эпитоп, по состоянию которого можно оценить качество окружающей данные объекты среды.

 

Требования к биоиндикаторам:

1. Низкий адаптивный потенциал к какому-то фактору (высокая чувствительность).
2. Короткий жизненный цикл.
3. Наоборот – высокая стойкость, а также даже привычка к взаимодействию с высокими концентрациям определенных элементов/веществ (картирование загрязненных поллютантами территорий). Могут использоваться искусственные биоиндикаторы (biosentinels – для использования в геологическом картировании).
4. Хорошая корреляция с изменениями в окружающей среде. (для повышения рабастности – четкие, жесткие, абсолютно адекватные ответы).
5. Анализ с помощью фрактальных вычислений статистических. (а не с помощью непараметрического критерия стьюдента). Потому что популяции – принципиально открытые системы, а не закрытые.

 

ИСКУССТВЕННЫЕ БИОИНДИКАТОРЫ 

Также в этом качестве могут выступать  рекомбинантные растения (нужный ген, связанный с определенной системой синтеза пигментов – то есть когда будет активироваться ген устойчивости, это будет заметно по приобретению растениями определенной окраски). Юзаются для определения залегания полезных веществ, например.

 

Критерии, применяемые к  виду-биоиндикатору:

1. Количество (должно изменяться быстро – от нескольких дней до нескольких месяцев задержка количественного) – снижение репродуктивного потенциала (влияет на ситему размножения) / гибель взрослых особей (не успевают адаптироваться).
2. Оценка размеров особей.
3. Оценка количества случаев развития опухолей.
4. Оценка зараженности паразитами. (таким образом мониторится статус иммунной системы)
5. Анатомические индексы. Соматогематотропный, например (размер печени). ЧСС (инфракрасные сенсоры определяют дистантно). Поведенческие маркеры (индикатор изменения в нервной регуляции, хорошо заметно на рыбах – появление нейротоксинов в воде; рисунок паутины пауков).

 

Токсическими являются только свободные ионы металлов, потому абсолютные значения концентрации малоинформативны (атомная спектрофотометрия). Поэтому биологическую силу загрязнения желательно определять биосенсорами (или ионные методы контроля – специфическая хроматография). Cu и Cr, например, нейтрализуют друг друга.

 

Проблемы биоиндикации:

1. На биологические системы воздействует сразу много факторов (время года, диета, пол, солнечная активность). Коктейль сублетальных факторов.
2. Относительная неспецифичность

Подходы:

1. Популяционный
2. Анатомический
3. Физиологический
4. Цитологический
5. Молекулярный

 

 

Некоторые био маркеры изменений в окружающей среде (дополняют резалты биоиндикаторных исследований):

 

Центральные молекулярные системы, обеспечивающие жизнедеятельность.

 

1. Металлотионеины – доклад – биологическая роль металлотионеинов. Индукторные белки (рост концентрации при индукции – загрязнении, опр. репродуктивной фазе, опр. возрасте, опр. температуре) – поэтому нужно знать фоновые значения в течение года и онтогенеза. И использовать только отлично изученные белки в виде биомаркеров.

Индукция при введении – через пару часов уже.

Есть КИТы (с антителами) – гомогенат раскапывается и через пару часов – опп-па. Удобная тест-система называется это.

2. Фитохелатины – у растений, аналог. Полипептиды, синтезируются нерибосомным способом (с помощью ферментов аминокислоты формируют пептид – у синезеленых такое – предковый способ считается, эволюционно более старый, нежели синтез на рибосомах).

Молекулы-детоксикаторы ксенобиотиков:

1. Глутатион - s -  трансфераза – помогает глутатиону (трипептиду, GSH) связываться с ксенобиотиками и окислять их, т.к. окисленные формы менее токсичны. Очень чувствительная система, относительно легко определить. Любое вещество. Вызывающее оксидативнй стресс приводит к усилению активности этой системы. Т.е. более индикатор генерализованного стресса.
2. Дегидралаза аминоленоленовой кислоты - Участвует в метаболизме гемоглобина – его активность ингибируется ртутью и серебром.
3. Ацетил-холин-эстераза – разрушает ацетил-холин в синаптической щели и пресинапсе. Маркер загрязнения пестицидами, они ее ингибируют (оценка нейротоксичности). Металлы, детергенты, альготоксины – также влияют на эту систему.
4. Цитохром-оксидазная система – в частности, цитохром Р450. Очень хорошо изучен. ИФА хорошо определяется.
5. Загрязнение пиреном (ароматическое соединение) определяется по спектру флюорисценции мочи ракообразных, желчи рыб, любых жидкостях беспозвоночных.
6. Белки  теплового шока. Не только к температуре устойчивость определяют – биомаркеры генерализованного стресса.
7. Биологические мебраны. Юзают краситель нейтральный красный – устойчивость лизосомальных мембран.

Методы оценки генотоксичности:

1. Выявление микроядер. Если во время митоза несколько хромосом не прикрепились к веретену деления, то есть в следующем делении они принимать учатсия не будут – они элиминируются и инфа с них теряется
2. Кометный анализ – выяляет двунитевые и однонитевые разрывы ДНК.
3. Оценка генотоксичести по образованию ДНК-аддуктов (ковалентная связь ксенобиотика с ДНК, первый шаг к канцерогенезу)

Репродуктивные маркеры:

1. Гистология гонад.
2. Оценка уровня половых гормонов.
3. Физиология гамет (изменение активности сперматозоидов, яйцеклеток и т.д.)
4. Развитие эмбрионов.
5. Соотношение полов.

Гормональные деструкторы  – нарушают гормональный гомеостаз. Близки к структуре природных гормонов, конкурируют и побеждают.

Их мониторят с помощью маркеров фертильности популяции:

1. Разнополых моллюсков. Nucella lapillus, например. Impasex – признаки самца начинают переноситься на самок – гормональные нарушения. У самок начинает расти пенис и семявыносящие протоки. Как самка уже не может функционировать, но и как самец тоже. Репродуктивный потенциал популяции снижается. Соответственно, длина пениса самок может выступать мерой загрязнения гормональными деструкторами (TBT-загрязнения, например). Трибутилин - компонент краски кораблей и днищ препятствующий заселению водорослями и моллюсками. 1 нг/л – малая концентрация, 10 нг/л – 50% импасексов. Также инсектициды, ароматические галогенизированные углеводороды, диоксин, различные фураны – тоже гормональные деструкторы (химические меметики эндогормонов).
2. Также у моллюсков – intersex – признаки самок у самцов. В мужских гонадах начинают формироваться ооциты.

 

 

Биоиндикация – в природной среде. ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Биотестирование – в лаборатории. Используются лабораторные линии – на оптимальном содержании, отличаются от диких. Менее устойчивы, чем дикие формы, к ксенобиотикам. Воду часто тестируют на лабораторных моделях (водорослевые, на дафниях).

Биосенсоры-ТОЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ, это прибор, меряет одно конкретное вещество. Востребованы в медицине (быстрые методы).

Грибы – устойчивы к  радионуклидам, накапливают их в  высоких концентрациях (стронций, например). До 200раз по отношению к почве, на которой они растут. Значит, у  них есть система защиты – деактивации  и хранения. В связи с этим (в  ходе адаптивного ответа на поллютант) они могут синтезировать вещества, токсичные для человеков.

Устрицы накапливают очень  сильно медь и цинк – у них  есть для этого специальные клетки. Которые окрашиваются в ядовито-зеленый цвет. У них циркулируют амебоциты, включающие в себя эти ионы металлов.

Также применяются микроорганизмы:

1. Метанотрофные бактерии – для определения локализации залежей метана.

 

Ремедиация – восстановление сильно загрязненных земель.

 

Удобства биосенсоров:

1. Медицинские наноустройства.
2. Быстрые методы анализ
3. Пищевая промышленность – алкогольные напитки, например. Производство антибиотиков.
4. Бытовые устройства –

Компоненты биосенсора:

1. Рецептор (использует биологическую активность живого вещества на узнавание и преобразование)
2. Трансдьюсор (регистрирует сигнал) – должен быть самым современным – тогда выше чувствительность
3. Аналоговый преобразователь (выдаёт число-исходное значение вещества)

     [с], [Q], [e^-]

 

 

 число

 

Варианты биологического узнавания:

1. Фермент-субстрат – Р¹ + р² . система регистрирует самый легкий в определении продукт, либо смену тепловой энергии.
2. Лиганд-рецептор
3. Антиген-антитело

Требования к биосенсору:

1. Сила сигнала рецептора должна быть достаточной для преобразования в электрический импульс.
2. Селективность (как можно меньше миметиков)

Пример: сенсор для  глутамина (аминокислоты) может быть усилен полупроницаемой мембраной. Для любого другого вещества можно тоже так усилять рецепторный элемент.

3. Минимальное время отклика
4. Максимальный. Диапазон концентрации
5. Длинная зона линейности калибровочного графика. Чем больше она и с большим углом наклона, тем лучше.

10^-12 г – 10^-15 г – хороший биосенсор

6. Максимальная воспроизводимость. Ошибка между измерениями должна быть не более 10-12%
7. Максимальный срок службы.

Предел обнаружения –  минимальная концентрация образовавшегося  вещества

 

Виды биосенсоров:

1. Тканевые. В виде рецептора – кусочек ткани. Требования к ним:

 Сигнал

                                                                            1 – кусочек ткани (толщина – 0.81-0.5 мм)

  2 - электрод

                                                                                    3 – аналит с буфером

 

 

Пример:

 На аргинин + рецептор-кусочек печени = мочевина + арнитин. Мочевина + уреаза = 2 аммиак (NH₃) + CO₂ . регистрируется количество аммиака. 1 аргинин = 2 молекулы аммиака.

 

Можно хранить в буфере с антибиотиками. Ткани могут  использовать в виде пасты – высушенный ацетоном гомогенат ткани, размазывают по электроду, т.к. паста сохраняет ферментативную активность.

 

Пример – печень, каталаза. По выходу кислорода (перекись (H₂O₂) = кислород + 2 вода) – кислородными электродами Кларка определяют.

Пример – глюкоза + глюкозооксидаза в присутствии кислорода = продукты. В таком случае этими же электродами Кларка регистрируют убыль кислорода, использованного для преобразования глюкозы.

 

При очистке ферментов (выделении  из тканей) изымается множество кофакторов, повышающих активность фермента. Поэтому их чувствительность значительно падает.

2. [Органоидные] – редко применяются
3. Клеточные. Чаще всего используются иммобилизованные бактериальные клетки. Селективность их может определяться подложкой (метаболиты образуемые)
4. Ферментные

3д конструкции органов  – регуляция активности клеток-предшественников  с помощью подложки.

 

Иммобилизация компонентов биосенсоров

Влияет на конформацию фермента, 30-40% активности – КПД успешной иммобилизации.

Преимущества иммобилизации  перед содержанием фермента в  растворе:

1. Многокраное использование
2. Автоматически продукт отделен от фермента
3. Может способствовать повышению температурной устойчивости белков. Т.к. число степеней свободы белковой молекулы оказывается ниже (она пришпилена во многих точках), она менее лабильна и в ней больше водородных связей – крепче третичная структура.
4. Увеличивается период полужизни белка.
5. Можно быстро остановить реакцию.
6. Оптимум pH при иммобилизации изменяется, это нужно использовать, чтоб сместить его в нужную для измерений сторону.
7. Подложка может «заменять» кофакторы.
8. После иммобилизации может снижаться чувствительность к ингибиторам ферментов.
9. Низкомолекулярные белки легче переносят иммобилизацию,чем высокомолекулярные.

Снижение функциональной активности при иммобилизации:

1. Может быть блокирован активный центр – он им упал на подложку и прилип.
2. Изменение конформации активного центра из-за механического изменения иных структур.
3. Изменение конформации активного центра из-за изменения побочных структур – изменение зарядов на поверхности – локальное изменение pH вокруг активного центра
4. Подход субстрата к активному центру механически заблокирован появившимися при иммобилизации структурами.
5. Невозможным становится акт конформационного дыхания (изменение концормации белка, которое происходит при работе фермента, при котором происходит э-м излучение).
6. Подложка может содержать токсичные по отношению в белку веществ, ядов для активного центра, заряженных групп, препятствующих активности фермента.
7. Среда иммобилизации должна быть избавлена от токсинов, могущих нарушить работу фермента.