Проект фармакопейной статьи на субстанцию гентамицина сульфата

 

Амикацина сульфат.

1. Гидролитическое расщепление с полной потерей активности.
2. Реакции на сахара – после кислотного гидролиза:
1. С реактивом Фелинга – образование кирпично-красного осадка оксида меди (I):

   основание амикацина                  6-амино-6-дезокси-      3-амино-3-

                                                                   D –глюкоза               дезокси-

                                                                                                         D –глюкоза

6-амино-6-дезокси-        Реактив Фелинга                6-амино-6дезокси-D-

     D –глюкоза                                                              глюконовая кислота

(альдегидная форма)                                                                                

2. С реактивом Несслера – выпадает чёрный осадок металлической ртути:

основание амикацина                  6-амино-6-дезокси-      3-амино-3-

                                                                   D –глюкоза               дезокси-D –глюкоза

 

         6-амино-6-дезокси-                                        6-амино-6дезокси-D-

               D –глюкоза                                                    глюконат калия

          (альдегидная  форма)   

3. С аммиачным раствором нитрата серебра – на стенках пробирки появляется «серебряное зеркало»:

 

основание амикацина                  6-амино-6-дезокси-      3-амино-3-

                                                     D –глюкоза               дезокси-D –глюкоза

   6-амино-6-дезокси-                                        6-амино-6дезокси-D-

      D –глюкоза                                                    глюконат аммония

(альдегидная форма)   

                                                                               

3. Образование окрашенных комплексов с солями тяжёлых металлов (отличие от канамицина). При реакции с кобальта нитратом после нейтрализации раствором гидроксида натрия наблюдается фиолетовое окрашивание.
4. Образование 5-аминометилфурфурола при нагревании с концентрированным минеральными кислотами, который открывают по реакции с антроном, в результате которой получается продукт голубого цвета:

5-аминометилфурфурол                                                          Продукт реакции голубого цвета

 

5. Реакция с раствором хлорида бария (обнаружение сульфат-иона): выпадает белый осадок сульфата бария и образуется основание амикацина:

 

Испытания на чистоту.

Поскольку аминогликозиды могут окисляться с образованием окрашенных и нерастворимых продуктов, в НД рекомендуется определение  прозрачности и цветности. Раствор  стрептомицина сульфата должен быть прозрачным и бесцветным в течение 24 ч. Растворы канамицина моносульфата и гентамицина сульфата должны быть прозрачными, допускается окраска, которая не должна быть интенсивнее определённого эталона цветности.

Аминогликозиды гигроскопичны, потому в НД нормируется потеря массы при высушивании в вакуум-сушильном шкафу (для стрептомицина сульфата она не должна превышать 5,0%, для канамицина моносульфата – 4,0%, гентамицина сульфата – 18,0%, амикацина – не более 13,0%).

Аминогликозиды получают методом биосинтеза, поэтому в них определяют токсичность, а у стрептомицина, кроме того, - содержание веществ гистаминоподобного действия. Для лекарственных форм, предназначенных для парентерального применения, определяют стерильность и пирогенность.

В канамицина моносульфате регламентируется содержание более токсичного канамицина В – не выше 5,0%. Определение проводится микробиологическим методом после кислотного гидролиза. В процессе кислотного гидролиза канамицин А разрушается полностью, а канамицин В – на 4/5. После нейтрализации раствора щелочью до рН 8,0-8,8 и добавления ацетатного буфера определяют активность в нейтрализованном гидролизате.

Кроме того, в гентамицина  сульфате выявляют специфические примеси  и сульфаты. Определение специфических  примесей проводится методом УФ-спектрофотометрии после нагревания препарата с 40% раствором серной кислоты. Оптическая плотность полученного раствора в УФ-области спектра при длине волны 280 нм должна быть не более 0,15.

Количество сульфатов  определяют гравиметрическим методом после реакции с бария хлоридом: гравиметрическая форма – бария сульфат. Содержание сульфатов в препарате должно быть от 31,0 до 34,0%.

 

Количественное  определение.

Количественное определение  аминогликозидных антибиотиков проводится микробиологическим методом диффузии в агар с определённым тест-микробом по соответствующему стандарту.

Для стрептомицина сульфата описаны также спектрофотометрические методы в видимой области спектра, основанные на цветных реакциях (мальтольной, с нингидрином и др.). Канамицин можно определять по цветной реакции с орцином.

Для этих же препаратов разработаны  методы ГЖХ, жидкостной хроматографии, полярографический метод и др.

Гентамицин можно количественно  определить нингидриновым,  полярографическим  и фотометрическим методом. Для фотометрического определения используют цветную реакцию с салициловым альдегидом при рН=7,0: образующееся при нагревании окрашенное салицилиденовое производное поглощает в области 405 нм.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ  И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

 

 

 

Утверждаю:

Бойцова Д.М.

25 апреля 2012 г.

 

 

 

Государственный стандарт качества

лекарственного средства

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ

 

 

 

Гентамицина сульфат                                              ФСП 42-000-00001-05

Субстанция

(Gentamicini sulfas)

 

 

Срок действия установлен

с «25»_______ мая _______2012

по «25»______ мая _______2017

 

 

ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ                         ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА

СПЕЦИФИКАЦИЯ

Гентамицина сульфат, субстанция.

Показатели	Методы	Нормы
Описание	Визуально	Белый или почти белый  гигроскопичный порошок без запаха.
Растворимость		Легко растворим в  воде, практически нерастворим в этаноле, эфире, хлороформе.
Подлинность	1. Тонкослойная хроматография;     2. Реакция с хлоридом  бария;   3. УФ-спектроскопия в области длин волн от 240 до 330 нм;	1. Три основных пятна на хроматограмме, полученные с тест-раствором, схожи в положении, цвете и размере с тремя основными пятнами хроматограммы раствора сравнения; 2. Выпадение белого  осадка, нерастворимого в соляной кислоте; 3. Отсутствие максимумов поглощения;
Удельное оптическое вращение	Международная фармакопея	[α]D20ºC = от +107 до +121º
Сульфатная зола	Международная фармакопея	Не более 10 мг/г.
Вода	По методу К. Фишера	Содержание воды не более 150 мг/г.
Значение рН	Международная фармакопея	рН раствора испытуемого  вещества с концентрацией 40 мг/мл составляет 3,5-5,5
Количественное определение	Микробиологический метод  диффузии в агар	Не менее 590 МЕ/мг в  пересчёте на безводное вещество.
Хранение		В плотно укупоренной  таре, предохраняющей от дейтсвия света
Срок годности		2 года со дня изготовления
Фарм. группа		Антибиотик

 

Нормативная документация

Гентамицина сульфат, субстанция.

Gentamicini sulfas.

Состав. Гентамицина сульфат является смесью сульфатов органических оснований, продуцируемых Micromonospora purpurea; основные компоненты – гентамицины С1, С1а, С2, С2а, С2b.

Содержание: минимум 590 МЕ / мг (безводного вещества).

Структурная формула.

Гентамицин С₁: R=R₁=CH₃;

Гентамицин С₂: R=CH₃, R₁=Н;

Гентамицин С_1а: R=R₁=H.

 

 

 

 

 

 

 

 

Описание. Белый или почти белый гигроскопичный порошок без запаха.

Растворимость. Легко растворим в воде, практически нерастворим в

этаноле, эфире и хлороформе.

Подлинность.

1. Тонкослойная хроматография.

В качестве сорбента используется силикагель Р5; встряхивают вместе 1 объём хлороформа, 1 объём метанола и 1 объём аммиака (~260 г/л), дают слоям разделиться и используют нижний слой в качестве подвижной фазы. Наносят на пластинку отдельно по 1 мкл каждого из 2 растворов, содержащих (А) 20 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 20 мг гентамицина сульфата СО в 1 мл. После извлечения пластинки из хроматографической камеры дают ей высохнуть на воздухе, опрыскивают её раствором трикетогидриндена в пиридине и ацетоне и нагревают 2 мин при 105ºС. Оценивают хроматограмму при дневном свете. Три основных пятна, которые даёт раствор А, соответствубт 3 основным пятнам, которые даёт раствор Б. Также для проявления хроматограммы можно использовать пары йода.

2. Раствор испытуемого вещества с концентрацией 10 мг/мл даёт характерную для сульфатов реакцию с раствором хлорида бария: образуется белый осадок, практически нерастворимый в соляной кислоте.
3. УФ-спектроскопия в области длин волн от 240 до 330 нм;

Удельное оптическое вращение. Используют раствор испытуемого вещества в концентрацией 0,10 мг/мл и пересчитывают результат на безводное вещество [α]_D^20ºC = от +107 до +121º.

Сульфатная  зола. Не более 10 мг/г.

Вода. Проводят определение по методу Карла Фишера (А): в сосуд для титрования вносят около 20 мл безводного метанола и титруют до конечной точки реактивом К. Фишера. Быстро вносят около 0,2 г (точная навеска) испытуемого вещества в сосуд для титрования. Перемешивают в течение 1 мин и снова титруют реактивом К. Фишера. Содержание воды не более 150 мг/г.

рН раствора. рН раствора испытуемого вещества с концентрацией 40 мг/мл составляет 3,5-5,5.

Количественное  определение. Проводится микробиологическим методом диффузии в агар, используя или Bacillus pumilus (штамм NCTC 8241; АТСС 14884), Bacillus subtilis (штамм АТСС 6633) или Staphylococcus aureus (штамм АТСС 6538Р) в качестве тест-организма, культуральную среду Kc1 с конечным значением рН 7,8, стерильный фосфатный буфер рН 8,0 ИР1 или ИР2, гентамицин в соотвенствующей концентрации (обычно 2-20 МЕ/мл) и температуру инкубации 35-39ºС. Точность определения такова, что фидуциальные пределы ошибки для найденной активности (Р=0,95) не менее 95 и не более 105% от найденной активности. Верхний фидуциальный предел ошибки для найденной активности (Р=0,95) не менее 590 МЕ/мг в пересчёте на безводное вещество.

Хранение. Гентамицина сульфат следует хранить в плотно укупоренной таре, предохраняющей от действия света. Препарат гигроскопичен. Даже в темноте он постепенно разрушается во влажной атмосфере, причём разрушение ускоряется при повышении температуры.

Срок годности. 2 года со дня изготовления.

Фармакологическая группа. Антибиотик.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Методика определения  гентамицина сульфата спектрофотометрическим методом.

В своей работе мне  хотелось бы предложить в качестве нового метода анализа комплексообразование аминогликозидных антибиотиков с катионами металлов как метод дериватизации для последующего определения полученного комплекса спектрофотометрическим методом.

Реагенты. Для анализа следует использовать фармакопейный препараты сульфата гентамицина в виде порошка во флаконах без наполнителя; соли гидро- и дигидрофосфата натрия.

Аппаратура. Спектрофотометр Specord M-40.

Методика эксперимента. Следует использовать 1×10^-2 -1×10^-5 М растворы гентамицина сульфата, полученные последовательным разбавлением исходного 0,1 М раствора бидистиллятом. Буферные растворы с рН 7,6 готовятся из растворов гидро- и дигидрофосфата натрия в бидистилляте. Для построения градуировочного графика для определения 0,03-0,1 мг/мл гентамицина сульфата в виде его комплекса с медью (II) в градуировочные пробирки вводится 0,1-1,0 мл исходного раствора гентамицина сульфата с интервалом 0,2 мл; 0,16 мл 0,0078 М раствора меди (II) разбавляют до 5 мл буферным раствором и через 5 минут измеряется оптическая плотность каждого раствора в кювете 1 см относительно воды при 250 нм.

При построении градуировочного  графика вводится поправка на оптическую плотность раствора меди (II), не связанной в комплекс с гентамицина сульфатом, используя формулу: А_выч=А_изм–∆А_Cu, где А_изм – оптическая плотность растворов проб, содержащих гентамицина сульфат и медь (II); ∆А_Cu – оптическая плоность раствора меди (II), не связанной в комплекс состава 1:1. ∆А_Cu=A_[Cu]–A_{[Cu]=[ген]}, A_[Cu] – оптическая плотность раствора введённой меди (II), A_{[Cu]=[ген]} – оптическая плотность комплекса.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Спектры светопоглощения. 1 – комплекс гентамицина сульфата с медью (II); 2 - меди (II); 3 – дифференциальная кривая при рН 7,6; 2,5×10^-4 М гентамицина сульфата; 2,5×10^-4 М Cu (II); l=1 см

 

Результаты. Светопоглощение гентамицина сульфата имеет максимум при 240 нм. При этой длине волны ɛ = (3,2±0,5)×10³. Известно, что обычно для увеличения чувствительности определения ионов металлов используют реакции комплексообразования. В данном анализе для увеличения чувствительности определения гентамицина сульфата использован метод его дериватизации катионом меди (II). Для изучения комплексообразования гентамицина сульфата с медью (II) была спектрофотометрически исследована данная система и предложена методика определения гентамицина сульфата. Спектры поглощения меди (II) и её комплекса с гентамицина сульфатом представлены на рис. 1. Максимальное различие оптической плотности комплекса меди (II) с гентамицина сульфатом и меди (II) наблюдается при 250 нм, при этой длине волны светопоглощение гентамицина сульфата незначительно.