Масс спектрометрический метод анализа

 

Анализаторы масс

 

Когда устройства ионизации смогли испарять и ионизировать биомолекулы, стало необходимо улучшить анализаторы масс до соответствующей скорости, точности и разрешения (рис. 2.1). Точнее, квадрупольные, квадрупольная ионная ловушка, времяпролётные (TOF), времяпролётные рефлекторные и циклотронные резонанса ионов анализаторы масс претерпели множественные модификации/улучшения за последние десять лет, чтобы соответствовать уровню MALDI и ESI. Сложнейшей проблемой оказалось совмещение устройств ионизации при атмосферном давлении (760 Торр) и анализаторов, в которых поддерживается 10-6 – 10-11 Торр, то есть, разница в давлении на 9 и более порядков. [10]

Анализ масс

Аналитические приборы обычно различаются в своих способностях в зависимости от индивидуального устройства и предназначения. Это верно и для масс-спектрометров. Хотя все масс-спектрометры содержат анализаторы масс, не все анализаторы работают одинаковым образом: некоторые разделяют ионы в пространстве, другие разделяют их по времени. В общих словах, масс-анализатор различает ионы в газовой фазе по их отношению массы к заряду (m/z), причём заряд может быть обусловлен присоединением или потерей протона(ов), катиона(ов), аниона(ов) или электрона(ов). Появление заряда заставляет молекулу подвергаться действию электрических полей, тем самым позволяя измерить её массу. Важно помнить, что анализаторы масс измеряют отношение m/z, а не массу. Часто это является камнем преткновения, так как ион оказывается многократно заряженным и m/z становится значительно меньше действительной массы (рис. 1.8 и 1.9). Например, дважды заряженный пептид массой 976.5 Да C37H68N16O142+ имеет m/z 488.3.

 

 

Многократная зарядка особенно характерна для ионизации электроспрея, давая многочисленные пики, относящиеся к одному образцу, но наблюдаемые при разных m/z.

Первые анализаторы масс, сделанные ещё в ранние 1900-е, использовали магнитное поле для разделения ионов по радиусу кривой, описываемой ими при прохождении через поле. Устройство современных анализаторов значительно изменилось в последние пять лет, сейчас обеспечивая намного большую точность, увеличенную чувствительность, более широкий диапазон масс и способность давать структурную информацию. Так как способы ионизации эволюционировали, анализаторы масс были вынуждены улучшиться на порядки, чтобы удовлетворить требованиям анализа большого разнообразия биомолекулярных ионов с точностью до одной миллионной и субфемтомольной чувствительностью. [11]

 

Таблица 2.1. Краткий обзор принципов работы анализаторов.

Анализатор масс Принцип работы   Квадрупольный Сканирование по частотам электромагнитного излучения   Квадрупольная ионная ловушка Сканирование по частотам электромагнитного излучения   Времяпролётный (TOF) Время пролёт прямо связано с m/z иона   Времяпролётныйрефлектрон Время пролёт прямо связано с m/z иона   Квадрупольный-TOF Сканирование по частотам электромагнитного излучения и определение времени полёта   Магнитный сектор Магнитное поле влияет на радиус траектории иона   Фурье-резонансный ионный  циклотронный MS Переводит движение иона в циклотроне в m/z (FTMS)

 

Рабочие характеристики анализаторов

Масс анализатор обычно оценивается по следующим характеристикам: точность, разрешение, диапазон масс, способность к тандемному анализу, скорость сканирования.

Точность

Точность – способность анализатора давать точную информацию о m/z. Точность в большой степени зависит от устойчивости прибора и от разрешения. Например, прибор с точностью 0.01% даёт информацию о 1000 Да пептиде с точностью ±0.1 Да, а для 10000 Да белка - ±1.0 Да. Точность серьёзно меняется от анализатора к анализатору в зависимости от типа анализатора и разрешения. Альтернативным способом описания точности является использование терминологии «части на миллион» (ppm), в которой1000 Да пептид с точностью ±0.1 Да может быть также описан как 1000.00 Да пептид ±100 ppm.

Разрешение (разрешающая сила)

Разрешение – способность масс-спектрометра различать ионы с различными отношениями массы к заряду. Поэтому большее разрешение связано с прямым увеличением способности различать ионы. Стандартным определением разрешения является следующее уравнение:

Разрешение = M/ΔM (2.1)

 

 
где M соответствует m/z, а ΔM является шириной на половине максимума (FWHM или «полушириной»).

 

Пример измерения разрешения показан на рис. 2.2, где пик имеет m/z 500 и полуширину 1. Получается разрешение M/ΔM = 500/1 = 500.

Разрешающая сила анализатора, в некоторой степени, определяет точность конкретного прибора, как показано на рис. 2.2. Средняя масса молекулы высчитывается с использованием эффективной массы всех изотопов каждого составляющего молекулу элемента. Моноизотопная масса рассчитывается с использованием массы изотопа элемента, имеющего наибольшую распространённость, для каждого из составляющих элементов. Если прибор не разрешает изотопы, он будет давать широкий пик, центр которого соответствует средней массе. Более высокое разрешение может даже разделить индивидуальные изотопы или же сузить пики, позволяя более точно определить их положение.

 

 

Диапазон масс

 

Это диапазон m/z анализатора масс. Например, квадрупольные анализаторы обычно определяют m/z до 3000. Анализатор магнитного сектора обычно определяет m/z до 10000, а времяпролётные анализаторы имеют практически неограниченный диапазон масс.

Тандемный анализ масс (MS/MS или MSn)

Это способность анализатора разделять различные молекулярные ионы, генерировать фрагментарные ионы от выбранного и измерять массы фрагментированных ионов. Фрагментированные ионы обычно используются для определения структуры исходных молекулярных ионов.

Обычно тандемная масс-спектрометрия проводится столкновением выбранного иона с молекулами инертного газа, такого как аргон или гелий, и последующим анализом образовавшихся фрагментов. Тандемный анализ масс используется для определения последовательности пептидов, структурных характеристик углеводов, малых олигонуклеотидов и липидов.

 

 

Термин «тандемный» анализ масс применяется для событий, последовательных в пространстве или во времени. Тандемный анализ масс в пространстве проводится последовательно расположенными анализаторами, тогда как тандемный во времени анализ масс осуществляется в одном и том же анализаторе, который отделяет нужный ион, фрагментирует его и анализирует фрагментарные ионы. Характеристики тандемного анализа для различных анализаторов приведены в таблице 2.2.

 

Скорость сканирования

Эта характеристика показывает скорость, с которой анализатор сканирует конкретный диапазон масс. Большинству приборов необходимо несколько секунд для полного сканирования, однако это время может сильно разниться в зависимости от анализатора. Времяпролётные анализаторы, например, совершают анализ в миллисекунды и даже быстрее. [12]

Конкретные виды анализаторов

Как известно, ESI и MALDI, например, генерируют ионы довольно различными способами. ESI Создаёт ионы в непрерывном потоке заряженных капель при атмосферном давлении, и ионы также создаются непрерывным потоком, по этим причинам квадрупольные анализаторы являются наиболее подходящими для ESI, так как они оба устойчивы к довольно высоким давлениям (~10-5 Торр) а и способны к непрерывному сканированию потока ионов из ESI. MALDI, с другой стороны, образует ионы посредством коротких, наносекундных, импульсов и хорошо совместимо с времяпролётным анализатором, который измеряет точно синхронизированные пакеты ионов, такие, как, например, полученные при помощи лазерного импульса.

Квадрупольный анализатор

 

 
Квадрупольный анализатор масс (рис. 2.3) используется с EI-устройствами с 1950-х и до сих пор является самым распространённым анализатором. Интересно, что квадрупольные анализаторы оказались очень удобными для совмещения с ESI и APCI. Квадруполи имеют три основных достоинства. Они устойчивы к относительно высоким давлениям.

Во-вторых, квадруполи имеют значительный диапазон масс – они способны к анализу до m/z порядка 4000, что удобно, так как ионизация электроспрея белков и других биомолекул обычно дают такое распределение заряда, что m/z лежит в пределах от 1000 до 3500. Наконец, квадрупольные масс-спектрометры являются относительно дешёвыми приборами. Учитывая взаимно дополняющие особенности ESI и квадруполей, неудивительно, что первый успешный коммерческий прибор электроспрея был оснащён квадрупольным анализатором масс.

Квадрупольные анализаторы параллельно соединены с радиочастотным (RF) генератором и постоянной разностью потенциалов (DC). При определённой частоте RF, только ионы с соответствующим m/z могут пройти через квадруполь, как показано на рис. 2.3, где только ионы с m/z 100 детектируются. Во всех трёх случаях на рис. 2.3 DC и RF поля одинаковы. Поэтому сканированием RF поля может быть анализирован широкий m/z - диапазон (обычно от 100 до 4000) приблизительно за одну секунду.

Для проведения тандемного анализа масс с квадрупольным прибором,

необходимо разместить три квадруполя в ряд. Каждый квадруполь иг

рает отдельную роль: первый квадруполь (Q1) используется для сканирова

ния определённого m/z диапазона и выбора нужного иона; второй квадруполь

(Q2), также известный как  ячейка столкновения, фокусирует  и пропускает 

ионы через подаваемый на путь пролёта вспомогательный газ (аргон или ге

лий); третий квадруполь (Q3) служит для анализа фрагментарных ионов, ге

нерированных в ячейке столкновения (Q2) (рис. 2.4). Последовательная схе

ма вызванной столк

 
новением ионизации (CID) показана на схеме 2.1.

 

Квадрупольная ионная ловушка

Анализатор ионной ловушки показан на рис. 2.5 (реальным размером примерно с теннисный мяч) был придуман в то же время, что и квадрупольный анализатор масс, тем же человеком, Вольфгангом Паулом. Кстати, физика в основе обоих этих анализаторов сходна. Однако в ионной ловушке, вместо того, чтобы проходить через квадрупольный анализатор с наложенным радиочастотным полем, ионы ловятся в такое квадрупольное поле. Один из методов использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов непосредственно внутри при помощи EI, с последующим анализом масс. Другой, более популярный, метод использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов во внешнем устройстве при помощи ESI или MALDI и использование ионной оптики для введения образца в объём ловушки. Квадрупольная ионная ловушка обычно состоит из кольцевого электрода и двух гиперболических закрывающих электродов (рис. 2.5). Движение ионов, вызванное электрическим полем этих электродов, позволяет поймать или выпустить ионы из ловушки. В нормальном состоянии, радиочастота сканируется, чтобы резонансно возбудить и, вследствие этого, выпустить ионы через маленькие отверстия в «крышках» детектора. По мере того, как сканирование RF достигает более высоких частот, ионы с более высоким m/z возбуждаются, выпускаются и детектируются.

Очень полезной особенностью ионных ловушек является то, что они способны изолировать один вид ионов, выпустив все остальные из ловушки. Изолированные ионы могут быть, затем фрагментированы посредством столкновений, а фрагменты проанализированы. Основное преимущество квадрупольных ионных ловушек – то, что эксперимент с диссоциацией, вызванной многократными столкновениями, может быть проведён быстро без использования дополнительных анализаторов, так, что LC-MS/MS в реальном времени сейчас является обычным делом. Другими важными преимуществами квадрупольных ионных ловушек являются малые размеры и их способность ловить и накапливать ионы для обеспечения лучшего ионного сигнала. Квадрупольные ионные ловушки были приспособлены для ряда различных целей: от EI-MSn (рис. 2.5) биомолекул до их более современных совмещений с MALDI. MSn позволяет многократным MS/MS экспериментам проводиться с последовательными фрагментарными ионами, давая дополнительную фрагментарную информацию. Но главнейшим применением ионных ловушек является определение белков. LC-MS/MS эксперименты проводятся для белковых гидролизатов, давая информацию одновременно по MS и MS/MS. Эта информация позволяет идентифицировать белки и характеризовать пост-трансляционную модификацию. Диапазон масс (~4000 m/z) коммерческих LC-ловушек хорошо соответствует значениям m/z, генерируемым ионизацией электроспрея пептидов, а разрешение позволяет идентифицировать зарядное состояние многозарядных ионов пептидов. Масс-спектрометры квадрупольной ионной ловушки могут анализировать пептиды из трипсинового гидролизата при их содержании порядка 20-100 фмоль. Другим ценным качеством техники ионной ловушки для анализа пептидов является её способность проводить несколько стадий масс-спектрометрии, которые значительно увеличивают количество структурной информации. [13]

Линейная ионная ловушкаЛинейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.

 

Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.

Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.

Двуфокусирующий магнитный секторПервые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m/z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m/z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и