Фармакопейный контроль качества андрогенов и эстрогенов

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Тестостерона энантат	Субстанция	МФ	ИК-спектроскопия ТСХ Реакция с серной кислотой и этанолом
		JP-2006	Реакция с раствором гидроксида калия в метаноле УФ-спектроскопия ИК-спектроскопия
		EP-2008	Первая идентификация: B. Вторая идентификация: A, C, D.
		BP-2009	Первая идентификация: B. Вторая идентификация: A, C, D.
		USP-24	ИК-спектроскопия УФ-спектроскопия Температура плавления от 151 до 1570 С

 

Идентификация тестостерона энантата по МФ проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом тестостерона энантата СО, или спектру сравнения тестостерона энантата.
2. ТСХ. В качестве сорбента используют кизельгур и смесь объемов жидкого парафина и 90 объемов петролейного эфира для импрегнирования пластинки путем погружения ее на глубину около 5 мл в жидкость. После того как растворитель достигнет высоты по крайней мере 16 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и оставляют ее при комнатной температуре до полного испарения растворителей. Используют импрегнированную пластинку в течение 2 ч, проводят хроматографию в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 4 объемов ледяной уксусной кислоты и 6 объемов воды. Наносят на пластинку отдельно по 2 мкл каждого из 2 растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 1 мл. Проводят хроматографию до прохождения фронтом растворителя отметки 12 см. После извлечения пластинки из хроматографической камеры дают ей высохнуть на воздухе до испарения растворителей, нагревают 5—10 мин при 120 °С, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают 10 мин при 120 °С. Дают остыть и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.
3. Суспендируют 5 мг испытуемого вещества в 2,0 мл смеси предварительно охлажденных 2 объемов серной кислоты (~1760 г/л) ИР и 1 объема этанола (~750г/л) ИР, затем помещают в водяную баню; появляется зеленовато-желтая флуоресценция, которая сменяется оранжевой, в то время как стенки пробирки окрашиваются в дихроичный синий цвет, сменяющийся красным ниже определенной глубины [10].

Идентификация тестостерона энантата по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. Нагревают 25 мг тестостерона энантата с 2 мл раствора гидроксида калия в метаноле (1 к 100) с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа, охлаждают  и добавляют 1 мл воды. Собирают полученный осадок путём всасывания, промывают водой до  тех пор пока последняя промывка не получится нейтральной, и сушат осадок в эксикаторе (в вакууме фосфора (V) оксида) в течение 4 часов: осадок плавится между 151° C и 157 °C.
2. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора тестостерона энантата в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора тестостерона энантата, полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

 

Рисунок 3 – Спектр в УФ-области тестостерона энантата

3. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения тестостерона энантата, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром  высушенного тестостерона энантата эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны [11].

 

Рисунок 4 – Инфракрасный спектр пропускания тестостерона энантата

 

Идентификация тестостерона энантата по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: от 34 ° C до 39 ° C.

В. Инфракрасная абсорбционная спектрофотометрия

С. ТСХ. В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь воды,ацетонитрила, 2-пропанола (20:40:60). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 10 частей метанола и 90 частей метиленхлорида, содержащих (А) 5 мг испытуемого вещества в 10 мл и(Б) 5 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл.После того как растворитель достигнет высоты 15 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе, а затем при 100 ° С в течение 10 мин, дают остыть. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм),а также путём опрыскивания спиртовым раствором серной кислоты, нагревают при 120 ° С 10 мин, дают остыть, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.

D. К 25 мг испытуемого образца добавляют 2 мл 10 г / л раствора гидроксида калия в  метаноле и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Добавляют 10 мл воды, подкисляют разбавленной соляной кислотой до тех пор, пока лакмусовая бумажка не станет красной. Фильтруют и промывают осадок небольшим количеством воды. Остаток после сушки при 60 ° С и при давлении, не превышающем 0,7 кПа, в течение 3 ч имеет температуру плавления от 150 ° С до 153 ° С [12, 13].

 

Идентификация тестостерона энантата по фармакопее США имеет одинаковые методики, что и в Японской фармакопее (ИК- и УФ-спектроскопии). Фармакопея США имеет также схожую методику проведения реакции с раствором гидроксида калия в метаноле, как и в Европейской фармакопее. Однако отличие состоит в том, что температура плавления образовавшегося осадка по фармакопее США имеет пределы от 1510 до 1570С [14].

 

2. Представители эстрогенных гормонов

Этинилэстрадиол

Таблица 4 – Сравнительная характеристика методов идентификации этинилэстрадиола

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Этинилэстрадиол	Субстанция	МФ	ИК-спектроскопия ТСХ
		JP-2006	Реакция с раствором этанола и серной кислоты Температура плавления между 200 ° и 202° С
		USP-24	ИК-спектроскопия УФ-спектроскопия Температура плавления от 180 ° до 186 °С

 

Идентификаци яэтинилэстрадиола по МФ проводится по следующим методикам:

1. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом этинилэстрадиола СО, или спектру сравнения этинилэстрадиола. Если спектр, полученный с испытуемым веществом в твердой фазе, не соответствует спектру, полученному со стандартным образцом, сравнивают спектры растворов в хлороформе , содержащих 30 мг/мл вещества, и используют кювету с толщиной слоя 0,2 мм.
2. ТСХ. В качестве адсорбента используют кизельгур и импрегнируют пластинку в смеси 1 объема пропиленгликоля и 9 объемов ацетона путем погружения ее на 5 мм ниже поверхности жидкости. Когда фронт растворителя пройдет не менее 16 см, вынимают пластинку из хроматографической камеры и выдерживают ее при комнатной температуре до полного испарения растворителя. Используют импрегнированную пластинку в пределах 2 ч с момента приготовления, проводя хроматографирование в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют толуол. Наносят отдельно на пластинку по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих: (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца этинилэстрадиола СО в 1 мл. Проводят хроматографирование до прохождения фронта растворителя на 15 см. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть до испарения растворителей, нагревают при 120 °С в течение 15 мин, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают при 120 °С в течение 5—10 мин. Дают пластинке охладиться и оценивают хроматограмму в дневном свете и в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б [10].

 

Идентификация этинилэстрадиола по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. Растворяют 2 мг этинилэстрадиола в 1 мл смеси этанола (95%) и серной кислоты (в соотношении 1:1): появляется пурпурно-красный цвет с желто-зеленой флуоресценцией. Добавляют 2 мл воды: цвет раствора изменится на красно-пурпурный.
2. В пробирку со стеклянной пробкой вносят 0,02 г этинилэстрадиола, растворяют в 10 мл водного раствора гидроксида калия (1:20),  добавляют 0.1 г бензоилхлорида и встряхивают. Собирают осадок, перекристаллизованный из метанола, и сушат в эксикаторе (в вакууме фосфора (V) оксида). Температура плавления осадка между 200 ° и 202° С [11].

 

Идентификация этинилэстрадиола по фармакопее США проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения этинилэстрадиола, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром  высушенного этинилэстрадиола эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.
2. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора этинилэстрадиола, полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.
3. Температура плавления от 180 ° до 186 °С [14].

 

Эстрадиолабензоат

Таблица 5 – Сравнительная характеристика методов идентификации эстрадиола бензоата

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Эстрадиола бензоат	Субстанция	JP-2006	Реакция с серной кислотой ИК-спектроскопия
		EP-2008	ИК-спектроскопия
		BP-2009	ИК-спектроскопия

 

 

Идентификация эстрадиола бензоата по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. К 2 мг эстрадиола бензоата добавить 2 мл серной кислоты: появляется желтовато-зеленое окрашивание с синей флуоресценцией. При осторожном добавлении 2 мл воды цвет раствора изменяется до светло-оранжевого.
2. ИК-спектроскопия. Определяют спектр инфракрасного поглощения эстрадиола бензоата, предварительно высушенного, и сравнивают с эталонным спектром или со спектром высушенного эстрадиола бензоата эталонного стандарта: оба спектра показывают подобные интенсивности поглощения при том же количестве волн [11].

 

Рисунок 5 – Инфракрасный спектр пропускания эстрадиола бензоата

 

Методика идентификации эстрадиола бензоата с помощью ИК-спектроскопии по Европейской и Британской фармакопеям не имеет существенных отличий по сравнению с этой же методикой по Японской фармакопее [12, 13]. 

 

4.Сравнительная характеристика методов количественного определения.

 

4.1. Представители андрогенных  гормонов

Таблица 6 – Сравнительная характеристика методов количественного определения

Вещество	ЛФ	Методика количественного определения
		МФ	JP-2006	EP-2008	BP-2009	USP-24
Метил-тестостерон	Субстанция	Спектро-фотомет-рия	ВЭЖХ	Спектро-фотомет-рия	Спектро-фотомет-рия	ВЭЖХ
Тестостерона энантат	Субстанция	Спектро-фотомет-рия	Спектро-фотомет-рия	Спектро-фотомет-рия	Спектро-фотомет-рия	Спектрофотометрия

Для количественного определения метилтестостерона Международная, Европейская и Британская фармакопеи рекомендуют спектрофотометрию. Для этого около 20 мг препарата (точная навеска) растворяют в достаточном количестве этанола (~750 г/л) до получения 100 мл; разводят 5,0 мл этого раствора до 100 мл тем же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме около 242 нм. Рассчитывают содержание С20Н30О2 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом метилтестостерона СО, который исследуют одновременно аналогичным образом. Поглощение раствора стандартного образца в правильно откалиброванном спектрофотометре должно составлять 0,54+0,03 [10, 12, 13]. Японская фармакопея и фармакопея США для количественного определения метилтестостерона рекомендуют ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и воды (11:9). Неподвижная фаза – селикагель. Детектируют спектрофотометрически при 241 нм [11].

Для количественного определения тестостерона энантата все 5 фармакопей рекомендуют метод спектрофотометрии. Для этого около 20 мг испытуемого вещества (точная навеска) растворяют в безводном этаноледо получения 100 мл раствора; разводят 5,0 мл этого раствора до 100 мл тем же растворителем. Измеряют поглощение разведенного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при максимуме около 241 нм. Рассчитывают содержание С26Н40О3 в испытуемом веществе путем сравнения со стандартным образцом тестостерона энантата СО, исследованным одновременно и аналогичным образом. В правильно откалиброванном спектрофотометре поглощение раствора стандартного образца тестостерона энантата СО в безводном этанолес концентрацией 10 мкг/мл должно быть 0,42 ±0,02 [10, 11, 12, 13, 14].