Теория клонирования

   Затем  Гордон  вместе  с  Ласки  (1970 год)  стали   культивировать  (вне  организма   в  питательной  среде)  клетки  почки, лёгкого  и  кожи  взрослых  животных  и  использовать  уже  эти  клетки  в   качестве  доноров  ядер. Примерно  25%  первично  реконструированных  яйцеклеток  развивались  до  стадии  бластулы. При  серийных  пересадках  они  развивались  до  стадии  головастика. Таким образом,  было  показано, что клетки  3-х разных  тканей  взрослого позвоночного  содержит  ядра, которые могут обеспечить  развитие  по  крайней может   до  стадии  головастика.В свою очередь Ди Берардино и Хофнер  использовали для трансплантации  ядра  неделящихся и полностью дифференцированных  клеток  крови – эритроцитов лягушки «Rana  Pipiens». После  серийной  пересадки  таких  ядер  10%  реконструированных  яйцеклеток  достигали  стадии  плавающего  головастика. Однако  даже  с  помощью  многократных  серийных  пересадок (более 100  клеточных циклов)  реконструированные  яйцеклетки  дальше  стадии  головастика не  развивались.Таким  образом,  во  многих  работах показано, что в случаи  амфибий донорами  ядер  могут стать лишь  зародыши  на  ранних  стадиях развития. Некоторые авторы  называют подобные  эксперименты  клонированием амфибий, хотя правильнее их  называть клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае  размножают  бесполым  путём не  взрослых  животных, а  их  зародышей.Дифференцировка  клеток  в ходе развития  позвоночных сопровождается  инактиваций  неработающих генов, поэтому клетки теряют  тотипотентность, дифференцировка становится  необратимой. В конце концов,  у одних клеток  происходит  репрессирование генома, у других  в той или иной  степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже  ядро. Однако на  ряду  с дифференцируемыми клетками, культивируемыми «in vitro» клеточные популяции содержат малодифференцируемые  стволовые клетки, которые и могут быть   использованы  как доноры  ядер  для  клонирования  млекопитающих.Опыты  с амфибиями показали, что ядра  различных клеток  одного  и того же  организма генетически идентичны и в процессе  дифференцирвки   постепенно теряют способность обеспечивать развитие  реконструированных  яйцеклеток, однако  серийные  пересадки ядер  и культивирование клеток  «in  vitro»  в  какой-то  степени  увеличивают  эту  способность.

 Неудачи  экспериментов  с  мышами.Успешные  опыты с амфибиями заставили задуматься  учёных  о клонировании  млекопитающих, в  частности  мышей.Мак Киннелл  в одной из  своих работах отмечал, что необходимые для этого методы  уже существуют  и непонятно почему  мышь до  сих пор не  клонирована.Однако  предсказания  Мак Киннелла  не сбылись, хотя  в конце 70-х   гг.  опыты на  мышах действительно начались  и протекали весьма  драматично. К тому  времени весьма  основательно  были  изучены биология  и генетика  ранних  этапов  развития  млекопитающих и в частности мыши  как  модельного  объекта. Работа  методически оказалась довольно   трудной, прежде  всего,  потому  что объём яйцеклетки  у млекопитающих примерно  в тысячу  раз меньше, чем у амфибий. Однако  эти трудности были  успешно преодолены. Экспериментаторы  научились  успешно  микрохирургическим  путём  удалять пронуклеусы  (одно  из  двух  гаплоидных  ядер  в яйце  млекопитающих, в период  после проникновения сперматозоида, но   до  слияния женского  и мужского  пронуклеусов  в ядро  зиготы  в процессе  оплодотворения. Мужское  ядро  формируется  из  ядерного  материала  сперматозоида, женское  из  хромосом  яйцеклетки)  из  зигот  мыши  и  пересаживать  в  них  клеточные  ядра  ранних  эмбрионов. Однако  все полученные  разным  способом  зародыши  мышей развивались лишь  до  стадии  бластулы.В  1977  году  появилось сенсационное  сообщение Хоппер  и Илменсе  о том, что они получили  7  взрослых  самок мышей, пять  из  которых имели только  материнский, а две отцовский геном. Это, якобы, зависело  от  того,  какой пронуклеус  был оставлен  в яйце – женский или мужской, он  и определял особи по  типу  гиногенеза  или андрогенеза (гиногенез – развитие  яйца  без участия сперматозоида, андрогенез – развитие  яйца, имеющие только  отцовские хромосомы – мужской партеногенез).

Их  успех  был  связан, по  описанию  авторов, с  тем, что,  удаляя  один  пронуклеус, они удваивали число хромосом   другого, обрабатывая яйца  специальным веществом, затем выращивали  полученные  диплоидные  гомозиготные  зародыши  in  vitro  до  стадии  бластулы  и пересаживали  в матку самки-реципиента  для дальнейшего развития.

Казалось, теперь  можно  будет  быстро  получить  млекопитающих  со  100%  гомозиготностью  по  всем  признакам. Это особенно  важно для селекции, так как для получения сельскохозяйственных  животных, в частности крупного  рогатого  скота с закреплёнными особо ценными качествами  обычными  приёмами  требуются десятки лет работы.

         Однако  данные  Хоппер  и  Ильменси  подтвердить не  удалось, хотя  многие  пытались  это сделать. Оказалось, что полученные  любым способом  диплоидные  андрогенетические и гиногенетические  зародыши  мышей погибают,  а тех же  стадиях, что и диплоидные  партеногенетические (развивающиеся из  неоплодотворённой яйцеклетки)   эмбрионы.

          Значительно  усовершенствовав  методы  извлечения  ядер  и  введения  их  в  клетку, Мак Грат   и  Солитер  провели  свою  серию  экспериментов  и  сообщили, что  высокий  выход  живых  мышей  они  получили, когда  в  качестве  доноров  ядер  они  использовали  зиготы, но  если  донорами  были  ранние  эмбрионы, то  реконструированные  яйцеклетки, как  и   прежде, развивались  только  до  стадии  бластулы.

Метод  Мак Грата- Солитера  стал  широко  использоваться  разными экспериментаторами. Так Манн  и Ловел-Банж  выделяли  пронуклеусы  яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживал их  в энуклеированные  зиготы  мышей. В этих  случаях эмбрионы  погибали  на  ранних  стадиях.

Если  же, наоборот, пронуклеусы  получали  из  оплодотворённых яиц и пересаживали  в партеногенетические и лишённые  ядра  яйца, то   такие зародыши  развивались нормально до  рождения.

 Сурами  с  соавторами  установили, что  если  добавить  женские  пронуклеус   из  зиготы  мыши  к гаплоидному набору  хромосом  яйцеклетки, то  нормального развития  не  происходит, добавление  же  мужского  ядра  приводит  к нормальному развитию. С    другой  стороны, рекомбинация  женского  и мужского  пронуклеусов  из  ранних  оплодотворённых яйцеклеток  мышей обеспечивает  нормальное  развитие, а комбинация  2-х мужских или 2-х женских пронуклеусов  останавливает развитие  эмбриона.

Эти  опыты  показали, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  два  набора  хромосом – отцовский  и  материнский. Поэтому  ни  у  одного  из  известного  вида  млекопитающих  не  описан  партеногенез. Поэтому  же  работы  Хоппер  и  Ильменсе  не  удалось повторить.

Однако такие исследование ещё дважды будоражили научное сообщество. В 1982  году  пересадили  ядра  клеток  партеногенетических бластул мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих  реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы получены  четыре взрослых самки, но  в свете вышесказанного эти результаты  маловероятны.

Гибель  партеногенетических  (гиногенетических и  андрогенетических)  зародышей  у  млекопитающих  связана  с  различной  активацией  онтогенеза  материнского  и  отцовских  геномов. Механизм, регулирующий  эти  функциональные  различия, был  назван  геномным  импритингом  и изучался  в  ряде  работ, где  было  показано, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  наличие  мужского  генома.

Другая  статья  Ильменсе  и Хоппер  имела ещё больший резонанс. Авторы  сообщили  о пересадки ядер  внутренней  клеточной массы   бластулы  в энуклеированные  зиготы  мышей и получения трёх  взрослых  особей  (двух  самок и одного  самца), генетически идентичной  донорской  линии  мышей.  Введение  ядер-доноров  и  удаление  пронуклеусов  из  зиготы  проводили за  один  приём, затем реконструированные  яйцеклетки  культивировали  «in  vitro»   до  стадии  бластулы и  пересаживали  в  матку  самок. Из  16  пересаженных  бластул три развились во  взрослые  особи. В следующей работе  эти же  авторы  использовали  в качестве  доноров-ядер  клетки  эмбрионов ещё более поздней стадии (семь  суток)  и будто бы  получили  трёх  половозрелых  мышей. Однако  никто из  работающих  в том же  направлении не  смог  добиться  подобных  результатов, и достоверность результатов Ильменсе  и Хоппер  вновь была  поставлена  под  сомнение. Мак Грат  и  Солитер  показали, что  ядра  8-клеточных  зародышей  и  клеток  внутренней  клеточной  массы  бластулы  не  обеспечивают  развития  «in  vitro»  реконструированных  яйцеклеток  даже  до  стадии  морулы, которая  предшествует  стадии  бластулы. Наибольшая  часть (5%) 4-клеточных зародышей даёт  возможность развиваться только  до  стадии  морулы. В тоже  время 19%  реконструированных  яйцеклеток  2-ядерных клеточных зародышей, смогли  спокойно  достичь стадии  морулы  или бластулы.

         Эти   и  другие  данные  показывают, что  в  эмбриогенезе  у   мышей  клеточное  ядро  рано  теряет  тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней  активизацией  генома  зародыша – уже на  стадиях двух  клеток. У других  млекопитающих, в частности у кроликов, овец  и крупного  рогатого  скота, активизация первой  группы  генов в эмбриогенезе  происходит  позднее, на  8-16  клеточной стадии.

Возможно,  поэтому  первые  значительные  успехи  в  клонировании  животных  были  достигнуты  на  других  видах  млекопитающих, а  не  на   мышах.

            Тем  не  менее,  особый  интерес   вызывают  опыты  группы  учёных  из  университета  в  Гонолулу  во  главе  с  Риузо  Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута. Они отказались  от  электрической стимуляции  слияния донорской соматической  клетки  с яйцеклеткой и изобрели  такую микропипетку, с помощью которой можно было  бы  безболезненно извлекать ядро  из  соматической  клетки  и трансплантировать его в обезъядренную  клетку. Кроме того, авторы  использовали  в качестве  донорских относительно  менее дифференцированные  ядра  клеток, окружающих  ооцит.  Наконец, удалось,  как бы  синхронизировать  процессы, протекающие в яйцеклетке  и трансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить  естественные  ядерно-цитоплазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой, поскольку трансплантируемое дифференцированное  в определённом  направлении ядро  и цитоплазма  яйцеклетки  до  того  работали  как бы  в разных  режимах.

         Авторы  использовали  для  трансплантации  ядра  клеток, окружающих  ооцит,  клеток  Сертоли  из  семенников  и клеток, выделенных  из  мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное  яйцо  с помощью микропипетки. Яйцо  активировали  к развитию, поместив  в специальный раствор , свободный от  кальция, и добавляя  стронций  и цитохалазин. Стронций  активировал яйцо, а кальций подавлял  образование полярных  телец. Эмбрионов культивировали  до  стадии  2-8  клеток, морулы  или бластулы, а затем трансплантировали в матку приёмной матери, где многие из них имплантировались  и некоторые из   них (15-16%)  продолжали  своё  развитие.

       Процент  выхода  рождённых  мышат (их извлекали  с помощью  кесарева  сечения  на 18, 19-й дни беременности) был,  однако, низок – в  разных  сериях  экспериментов от 2  до  2,8%. Молекулярные  исследования  доказали  принадлежность ядер  рождённых  мышат  к  клеткам   донора  соматических  клеток. Таким  образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие  млекопитающих. Но работы  с  мышами, значительно  расширили  наши  представления  о  методологии  млекопитающих.