Шпаргалка по дисциплине "Микробиология"

Питательные среды

Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов.

В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для большинства бактерий благоприятной является питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоприятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, грибы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.

По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи. Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.

Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.

По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Обычные (простые) питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.

Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других по их ферментативной активности (см. соответствующий раздел).

23. Рост и размножение микробов. Определение понятия: фазы размножения, причины отмирания микробов. Условия культивирования.

Рост и размножение микроорганизмов

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной особи, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, врастающая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну материнскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Большинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии туберкулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определенного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на котором по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат логарифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз:

1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии  адаптируются к питательной среде, количество их не увеличивается;

2) фаза логарифмического роста - количество бактерий увеличивается в геометрической прогрессии;

3) фаза стационарного роста, во  время которой число вновь  образованных бактерий уравнивается числом погибших, и количество живых бактерий остается постоянным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4) фаза отмирания, когда число  отмирающих клеток начинает преобладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде называется периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное культивирование применяют в микробиологической промышленности.

Обычно причиной гибели микроорганизмов, при их поддержании на плотных питательных

средах, является их обезвоживание. Применение в качестве среды для поддержания культуры

полужидкого питательного агара и засев микроорганизмов "уколом" внутрь агара уменьшают риск обезвоживания. Преследуя ту же цель, покрывают растущие на скошенном агаре или столбиках агара культуры слоем жидкого стерильного минерального масла вазелинового или парафинового) толщиной 2см.

Условия культивирования : температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

24. Процесс дыхания микроорганизмов. Классификация микроорганизмов  по способу дыхания. Схемы биологического окисления у аэробов и анаэробов.

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последовательном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кислоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окисления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кислород, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называется брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образованием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с образованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.

При анаэробном типе биологического окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Все микроорганизмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободного кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, холерный вибрион, чудесную палочку. ,

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислительно-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО2 и Н2О. Более того, в присутствии свободного кислорода образуются токсические соединения: перекись водорода Н2О2 и свободный перекисный радикал кислорода О2. Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор ферментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до конечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших количеств кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

25. Методы культивирования облигатных  анаэробов: принципы, аппаратура.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха  с помощью насоса из анаэростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей  редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее  надежный способ - выращивание в  глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят  путем смешивания с расплавленным  теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);

2) посев материала производят  на чашки с питательной средой  и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсснера).

26. Значение определения морфологических  и культуральных свойств микробов  в микробиологической диагностике (привести конкретные примеры).

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов.

27. Ферменты микробов. Классификация  по биологической роли и субстратной  специфичности; использование для  идентификации микробов.

Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характерным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фермент участвует только в определенной реакции с определенным химическим соединением.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окружающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные антибиотики, защищая бактерии от их действия.