РАДИОАКТИВНОЕ МАРКИРОВАНИЕ И ИММУНОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

РАДИОАКТИВНОЕ МАРКИРОВАНИЕ И ИММУНОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ  МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ

КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Располагая специфическими антисыворотками, можно в чистом виде выделять небольшие количества меченых компонентов поверхностной клеточной мембраны из лейкоцитарного (или иного) лизата. Для этого используется простой метод, состоящий из трех этапов.

Первый этап – включение  изотопной метки в клеточные макромолекулы путем химического присоединения, биосинтеза или ферментативного катализа. Обычно клеточные белки метят иодированием с помощью лактопероксидазы или включением радиоактивных аминокислот в процессе биосинтеза в кратковременной клеточной культуре. Гликопротеиды и углеводы можно пометить методом восстановления боргидридом или путем биосинтетического включения радиоактивных сахаров (процедура сходна с включением радиоактивных аминокислот).

На втором этапе меченные клетки разрушают в среде, содержащей обычно неионный детергент, который вызывает солюбилизацию мембран. Чтобы выделить нужные макромолекулы, лизат наносят на колонку иммуносорбента или смешивают его со специфической антисывороткой; во втором, более удобном варианте образовавшиеся иммунные комплексы выделяют, добавляя либо вторую антисыворотку – к иммуноглобулинам первой (непрямая иммунопреципитация), либо взвесь стафилококков, несущих белок А, который связывает иммуноглобулины.

Перед специфической очисткой желательно удалить примеси, которые  могли бы неспецифически связаться с иммуносорбентом или иммунным преципитатом. Кроме того, из лейкоцитарного лизата нужно удалить меченые иммуноглобулины, которые связаны с клеточной поверхностью (если они сами не являются предметом исследования). Эти примеси удаляют путем осаждения или адсорбции перед этапом специфической очистки.

Очищенный таким образом  радиоактивный материал может быть далее подвергнут анализу методом ЭФ в ПААГ с ДДС Na.

МЕТОДИКА МАРКИРОВАНИЯ

Иодирование белков клеточной поверхности с помощью лактопероксидазы

Точный механизм происходящей реакции неизвестен. Предполагают, что в присутствии лактопероксидазы и перекиси водорода иодит-ионы окисляются и дают связанный с ферментом промежуточный продукт, который может превращать доступные остатки тирозина в белке в одноиодистые производные. Может также иодироваться гистидин, нов гораздо меньшей степени.

Метод лактопероксидазного иодирования технически несложен; при этом выявлять радиоактивный иод ( с помощью γ-счетчиков или радиоавтографии) гораздо проще чем тритиевую метку.

 

Биосинтетическое маркирование поверхностных белков

Включение радиоактивных  аминокислот в белок в процессе его биосинтеза было использовано при  изучении поверхностных иммуноглобулинов клетки и антигенов гистосовместимости. В такого рода опытах часто используют лейцин и лизин; эти АМК в значительном количестве содержатся в большинстве белков, и их ³Н-производные обладают высокой удельной активностью.

Степень включения метки  в различные белки в клетках  разных типов очень сильно варьирует.

Для биосинтетического маркирования белков можно использовать также предшественники, меченные другими изотопами(³⁵S-метионин).

Клетки инкубируют в чашках Петри, используют модифицированную среду  Игла.

 

 

В 10 мл среды инкубируют 5*10⁷ живых клеток при 37 ⁰С в течение 6-8 ч в атмосфере с 5% СО_2; затем суспензию сливают, промывают холодным ЗБР (забуференный боратами физиологический раствор) 4 раза, содержащим

10^-3 М ТСФ (толуолсульфофторид).

МАРКИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ  УГЛЕВОДОВ КЛЕТКИ ПУТЕМ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БОРГИДРИДОМ

 

 

РАЗРУШЕНИЕ МЕЧЕНЫХ КЛЕТОК

В неионном детергенте. Концентрация должна быть достаточной, чтобы разрушить клеточные, но не ядерные мембраны.