Приготовление питательной среды для культивирования продуцентов лизина

Учреждение  образования «БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

 

Факультет Технология органических веществ

Кафедра    Биотехнологии и биоэкологи

Специальность Биотехнология

Специализация

 

 

 

 

 

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА 

КУРСОВОГО ПРОЕКТА

по  дисциплине Оборудование и проектирование микробиологических производств

Тема Проект участка по приготовлению питательных сред в производстве лизина

 

 

 

 

 

 

 

                                       Исполнитель

                   Студент(ка) 5 курса заочного факультета                                    А. Ю. Каленик

                                                                                              подпись, дата                инициалы и фамилия

                                   Руководитель 

.

                               должность, ученая степень, ученое  звание     подпись, дата             инициалы и фамилия

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Курсовой проект защищен с оценкой

Руководитель                                                   

                                              подпись                                                    инициалы и фамилия

 

 

 

 

 

 

Минск 2013

 

Введение

Лизин (α, ε-аминокапроновая кислота) известен в виде двух оптически активных  D- и L-форм и рацемической DL-формы. Эмпирическая формула C₆H₁₂N₂O₂. Молекулярная масса 146,19. Лизин хорошо растворим в воде, кислотах, основаниях, трудно растворим в спирте и нерастворим в эфире. Аминокислота при температуре 224 – 225 ^оС разлагается. Кристаллизуется лизин в виде бесцветных игл гексагональных пластинок.

Установлено, что в организме  лизин определяет не только биологическую ценность белка. Аминокислота выполняет много и других биохимических функций – она способствует секреции пищеварительных ферментов и транспорту кальция в клетки, улучшает общий азотный баланс в организме. Применение лизина в хлебопекарной промышленности повышает биологическую ценность и улучшает качество изделий. От добавления лизина в рационы животных (0,2 – 0,4%) значительно увеличивается коэффициент использования белка, и тем самым снижается расход кормов на единицу продукции. [1]

Из L-лизина и некоторых его предшественников получают соединения, которые применяются для удаления листьев с различных культурных растений.

Лизин и другие аминокислоты могут  быть использованы в качестве обогатителя  пищевых растительных продуктов  для повышения их питательной ценности и для сбалансирования пищи по незаменимым аминокислотам.

Лизин (гистидин, аланин, пролин, валин, лейцин) могут с успехом использоваться не только для повышения питательной ценности пищевого продукта, но и как соединения, помогающие снять неприятные или нежелательные запахи.

В пищевой промышленности лизин (глицин, метионин, триптофан, аргинин, аспаргин, изолейцин)  применяют в качестве антиокислителя. [2]

 

1. Выбор и обоснование технологической схемы

1.1 Выбор продуцента

Путем микробного синтеза лизин  можно получить двумя способами:

1. Трансформацией предшественников L-лизина с помощью ферментных систем микроорганизмов до L- лизина;

2. Получением с помощью мутантого штамма бактерий, с нарушенным синтезом гомосериндегидрогеназы, прямым синтезом L-лизина без предшественника, способного образовывать L-лизина свыше 40 г/л.

В первом варианте используются в  качестве предшественников L- и DL-диаминопимелиновая кислота, DL-5 (4-аминобутил) гидантоин, 5-формил-2-оксивалериановая кислота, L-кетоадипиновая кислота, DL- и L-аминокапрлактам, DL-аспаргиновая кислота. В качестве продуцентов нужного комплекса ферментов используются E. coli, artrobacter, Saccharomyces cerevisiae, Coryriebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum и др. [2]

Во втором варианте используются мутанты, способные продуцировать L-лизин и имеющие нарушения в цепи синтеза треонина, изолейцина, метионина. Для прямого синтеза используются мутанты ауксотрофных бактерий из рода Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др.[1]

В данной курсовом проекте лизин  получают по второму варианту. Этот способ является гораздо более эффективным, т.к. не требует использования предшественников лизина.

Полиауксотрофные мутанты с  нарушенным синтезом гомосериндегидрогеназы или гомосеринкиназы и с дополнительно введенным нарушением в цепи синтеза гистидина, изолейцина, валина или лейцина оказываются на 10 – 20% более продуктивными по L-лизину (таблица 1.1).

Таблица 1.1 – Продуктивность и потребность в аминокислотах мутантных микроорганизмов.

Вид микроорганизма	Потребность в аминокислотах (нарушен синтез этих аминокислот)		Выход лизина, г/л
1	2		3
Corynebacterium glutamicum ATCC 13286	Гомосерин (треонин + метионин)		41
ATCC 21253	Гомосерин + лейцин		52
ATCC 21254	Гомосерин + гистидин		51
ATCC 21255	Гомосерин + изолейцин + валин		52
Brevibacterium flavum         H-1013	Гомосерин		43
TM-15-29	Треонин + метионин		23
Продолжение таблицы 1.1
1	2	3
Brevibacterium lactofermentum ATCC 21086	Треонин + изолейцин + валин
Brevibacterium sp. 22	Гомосерин	27
Corynebacterium glutamicum T-3	Гомосерин + изолейцин + валин	38

Таким образом продуцентами L-лизина для его промышленного получения являются исключительно мутанты из группы глутаматсинтезирующих бактерий относящихся к группе коринобактерий.

Большинство продуцентов лизина обладают чрезвычайно неустойчивым аминокислотным обменом, подверженным воздействию внешних условий: состава питательной среды, количества растворенного в среде кислорода, температуры выращивания, рН среды, длительности культивирования, возраста, количества посевного материала и т. д. [2]

Для прямого биологического синтеза  L-лизина в данном курсовом проекте используем Brevibacterium flavum H-1013, так как рост и биосинтез этого продуцента зависит от содержания в питательной среде: гомосерина, биотина, тиамина (в отличие от других видов), имеет продуктивность 43 г/л L-лизина.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2 Выбор компонентов питательной  среды

Для нормального роста, развития культуры и биосинтеза ею L-лизина необходимо в состав среды вводить источники углерода. Хорошими источниками углерода являются моно- и дисахариды: глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза.

Максимальный биосинтез L-лизина наблюдается на средах с сахарозой. Лактоза, раффиноза пентозы практически не могут быть для продуцентов лизина источниками углерода, так как почти ими не усваиваются.

В промышленных условиях в качестве источника углеводов применяют  свекловичную или тростниковую мелассу, гидрол, различные гидролизаты целлюлозосодержащего сырья, а также гидролизаты крахмала. Наилучшие результаты получаются при выращивании продуцентов лизина на мелассе. В среднем выход лизина на мелассах составляет 25% от введенного в процесс сахара, а для некоторых мутантов он может достигать 30 – 33%.

Источник азота обычно вносят в  состав среды либо в виде солей  аммония, или в виде мочевины, а также кукурузный экстракт, гидролизаты кормовых, пекарских дрожжей и казеина. Кукурузный экстракт, гидролизаты кормовых, пекарских дрожжей и казеина играют также роль ростовых факторов: содержат в себе дефицитные для ауксотрофного мутанта аминокислоты и витамины. Нормальное течение процесса биосинтеза обеспечивается добавками солей макроэлементов: калия, фосфора, магния. Добавок микроэлементов, как правило, не производят, они содержатся в достаточном количестве в кукурузном экстракте и гидролизатах дрожжей.

Высокую концентрацию лизина (до 60 г/л) в культуральной жидкости можно  получить на мелассной среде, если во время ферментации вести подкормку путем дробной подачи части питательной среды.

Выращивание производим на среде следующего состава:

Состав исходной питательной среды, кг/м³: меласса  – 170; кислотный гидролизат кормовых дрожжей – 20 (в расчете на товарные кормовые дрожжи); NH₄Cl – 5; K₂HPO₄ – 0,5; вода (конденсат ВВУ) – остальное.

Состав подпитки, кг/м³: меласса – 400; кислотный гидролизат кормовых дрожжей – 15 (в расчете на товарные кормовые дрожжи); NH₄Cl – 12; K₂HPO₄ – 0,3;; вода (конденсат ВВУ) – остальное. [3]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.3 Выбор установки для стерилизации  среды

При производстве аминокислот стадия стерилизации питательных сред или их компонентов является обязательной. Известны способы стерилизации сред ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами, ионизирующим излучением, ультразвуком, термической обработкой и химическими соединениями.

Основным в микробиологической промышленности является термический  способ стерилизации сред при температурах до 140 ^оС.

 Стерилизацию питательных сред можно вести двумя способами: периодическим и непрерывным. Периодическим способом стерилизацию питательных сред или ее компонентов целесообразно проводить в ферментаторах и сателлитах, вместимость которых не превышает 0,5 м³. Жидкую среду после загрузки в ферментатор нагревают до определенной температуры путем подачи пара через все штуцера аппарата. Этим приемом достигается одновременная стерилизация труб и арматуры. При заполнении аппарата средой учитывают ее разбавление за счет конденсата пара. После расчетной выдержки среду охлаждают путем подачи в рубашку холодной воды.

Положительной стороной периодического способа стерилизации является простота оборудования, высокая надежность стерилизации, невысокие затраты труда. К основным недостаткам следует отнести низкую производительность и невысокое качество питательных сред.

Стерилизация в больших емкостях приводит к снижению производительности аппаратов вследствие увеличения длительности нагрева и охлаждения сред.

 Непрерывный способ стерилизации жидких сред является более прогрессивным по сравнению с периодическим, особенно при расходах среды, превышающих 2 м³/ч. При этом способе приготовленные растворы или суспензии компонентов питательных сред в смеси или раздельно стерилизуют в установке непрерывной стерилизации (УНС). Использование УНС позволяет получить более качественные питательные среды и увеличить производительность ферментатора. Существующие схемы УНС имеют много общего и включают приемную емкость для нестерильной среды, насос для ее подачи, сетчатый фильтр из кислотостойкой стали, нагреватель, выдерживатель (стерилизатор) и теплообменник. С целью регенерации тепла целесообразно использовать рекуператор тепла.

Нагреватель предназначается для нагрева питательной среды до температуры стерилизации. К нагревателям относятся колонны, инжекторы, пластинчатые теплообменники и др.

В микробиологической промышленности хорошо зарекомендовали себя нагреватели колонного типа различной конструкции и мощности, принцип нагрева которых основан на смешении жидкой среды с острым паром. Нестерильная питательная среда после очистки в фильтре от твердых частиц размером более 1 мм подается вихревым насосом в нагреватель через центральную трубку. При наличии рекуператора тепла среда предварительно нагревается до температуры 120 ^оС. Внутренняя часть центральной трубы нагревателя имеет большое количество отверстий диаметром 2 мм, через которые поступает острый пар давлением около 0,5 – 0,6 МПа. среда нагревается от начальной температуры до заданной (130 – 140 ^оС) за несколько секунд за счет интенсивного смешения с паром в трубе и при прохождении через рассеивающий зонт в корпусе колонны.

Выдерживатель непрерывного действия предназначен для пребывания в нем каждого элементарного объема питательной среды в течение времени, необходимого для гибели наиболее термоустойчивых спор микроорганизмов. При идеальном (поршневом) течении жидкости время выдержки элементарных объемов среды соответствует расчетному времени гибели спор, и качество питательной среды в этом случае наилутшее.

В микробиологической промышленности применяются емкостные и трубчатые выдерживатели. В емкостных выдерживателях вследствие значительных диаметров аппаратов трудно создать поршневой поток без специальных устройств. Удовлетворительную равномерность потока по цилиндру аппарата достигают путем установки внутри него тарелок с отверстиями, решеток, отражателей потока жидкости при входе в аппарат и других устройств.

В выдерживателях трубчатого типа эффект, близкий к поршневому вытеснению жидкости, достигается без особых затруднений. Трубчатый выдерживатель состоит из вертикальных труб, соединенных последовательно. Внутренний диаметр трубы 0,4 – 0,6 м, длина каждой трубы 6 – 8 м. Общая длина труб зависит от времени выдержки среды. Для сохранения постоянства температуры стерилизуемой среды трубы покрываются теплоизоляционным материалом, или в рубашку трубы подается пар. Общий объем выдерживателя рассчитывается с учетом времени выдержки среды в потоке, необходимого для ее стерилизации. Из выдерживателя стерильная среда поступает в рекуператор или теплообменник.

Теплообменник в УНС служит для охлаждения стерильной среды до температуры биосинтеза. Теплообменник должен быть герметичным, чтобы исключить инфицирование среды. В микробиологической промышленности для охлаждения сред широко применяются теплообменники «труба в трубе» несмотря на их громоздкость, сложность очистки от накипи, образующейся на внутренней поверхности труб, и большого расхода металла по сравнению с другими типами теплообменников. Спиральные теплообменники имеют высокую эффективность, но не находят применения из-за плохой герметичности между торцами листов и крышками. Кожухатрубные теплообменники также не применяются, так как большое число труб в трубной доске способствует внесению инфекции в среду вместе с водой через неплотности. Наиболее перспективными являются пластинчатые теплообменники, обладающие высокой герметичностью и доступностью при очистке от накипи.[4]