Понятие о гене, свойства генов. Структурная организация генов прокариот и эукариот

 

Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций.

Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.

 

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому информативность метода прямой ДНК-диагностики широко варьирует. Так, при диагностике хореи Гентингтона, ахондроплазии она составляет 100 %, при фенилкетонурии, муковосицидозе, адреногенитальном синдроме - от 70 до 80 %, а при болезни Вильсона-Коновалова и миопатии Дюшенна/Бекера — 45-60 %. В связи с этим используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

 

 

Косвенные методы ДНК-диагностики

 

Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантиых, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях, т.е. среди родственников обследуемого лица. Это особенно важно при решении вопроса о пренатальной (дородовой) диагностике наследственного заболевания.

 

При использовании косвенных методов ДНК-диагностики следует помнить — чем теснее сцепление между маркерным локусом и мутантным геном, тем точнее диагноз. Чтобы свести до минимума ошибку диагностики, необходимо по возможности использовать внутригенные маркеры или использовать два маркерных локуса, фланкирующих мутантный аллель.

 

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть определена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизирующихся со специфическими ДНК-зондами (ПДРФ-анализ; Restriction Fragment Length Polymorphism, или RFLP-анализ).

 

Метод ПДРФ-анализа включает проведение нескольких этапов исследования: выделение геномной ДНК; рестрикция выделенной ДНК с помощью специфических эндонуклеаз; электрофоретическое разделение фрагментов ДНК; идентификация фрагментов ДНК, содержащая полиморфный сайт рестрикции с помощью блот-гибридизации по Саузерну. При отсутствии рестрикции ДНК по данным радиоавтографии будет выявляться крупный (неразрезанный фрагмент, или бэнд).

 

При наличии рестрикции будет выявляться меньший по размерам фрагмент. У лиц, гомозиготных по данному наследственному заболеванию, будет выявляться один бэнд, в то время как у лиц, гетерозиготных по данному наследственному моногенному дефекту, будут определяться оба фрагмента. ПДРФ-анализ значительно упрощается, если имеется возможность специфической амплификации участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Проведение в этом случае ПЦР-реакции и рестрикции амплифицированного фрагмента позволяет провести тестирование состояния этого локуса.

 

Таким образом, косвенная ДНК-диагностика проводится в следующих случаях:

1) когда  ген не идентифицирован, а лишь  картирован на определенной хромосоме,

2) когда  методы прямой ДНК-диагностики  не дают результата (например, в  силу большой протяженности гена  или широком спектре мутационных  изменений,

3) при  сложной экзонно-интронной организации  гена.

 

При использовании косвенных методов ДНК-диагностики требуется семейный анализ аллелей полиморфных маркеров.

Для косвенной диагностики могут использоваться так называемые гипервариабельные сателлитные повторы. Они являются более информативными методами, чем ПДРФ-анализ, поскольку обладают высоким уровнем гетерозиготности и плотно расположены в каждой из хромосом. В последние годы используются короткие тандемные повторы (STR-повторы, short tandem repeates), которые стабильно наследуются и обладают большим уровнем полиморфизма, а также короткие секвенированные последовательности ДНК с известной генной локализацией, так называемые STS-повторы (sequence tagged sites).

 

Последние обладают выраженной индивидуальной специфичностью, стабильно наследуются по законам Менделя и находят широкое применение для молекулярно-генетической диагностики моногенных болезней. Они могут также использоваться в качестве молекулярных маркеров мутантных хромосом в семьях высокого риска. Косвенные методы ДНК-диагностики могут использоваться в пренаталньой диагностике практически для всех моногенных заболеваний. Однако для этого необходимо иметь знания о том, что локус является высокополиморфным и находится вблизи от мутантного гена или внутри него. Поэтому для диагностики требуется обследование как можно большего числа родственников (в первую очередь родители—дети), чтобы проследить путь передачи маркеров потомству. Это повышает информативность выбранного маркера.

18-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Идентификация генов, участвующих в развитии болезней человека.

Позиционное клонирование - это выделение гена только на основании его положения в геноме, без знания функции. Этот подход основан на анализе образцов ДНК из семей больных с целью поиска генетического маркера, расположенного рядом с вызывающим заболевание мутантным геном. Приблизительно локализовав мутантный ген, получают перекрывающиеся клоны, содержащие этот участок ДНК, после чего идентифицируют гены и устанавливают, какой из них вызывает заболевание, часто путем выявления небольших мутаций в одном из них ( рис. 65.14 ). Задача облегчается, если известны хромосомные транслокации, которые можно использовать для картирования и идентификации мутантного гена. С помощью этого подхода выявлены мутантный ген, вызывающий миопатию Дюшенна , мутантный ген, вызывающий муковисцидоз , мутантный ген, вызывающий ретинобластому , мутантный ген, вызывающий аденоматозный полипоз толстой кишки , мутантный ген, вызывающий нейрофиброматоз , мутантный ген, вызывающий болезнь Гентингтона , мутантный ген, вызывающий семейный рак молочной железы типа 1 и мутантный ген, вызывающий семейный рак молочной железы типа 2 .

19---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Назовите преимущества прямых методов ДНК-диагностики

 

(тоже самое есть и в 17 вопросе)

Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей.

20------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Генно-инженерные технологии — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

21---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Основные внутриклеточные органеллы. (определение, виды)

Экстраклеточный матрикс. Функции ЭКМ заключаются в обеспечении и поддержании формы клетки, транспорта веществ и ионов, предохранении клетки от проникновения инфекции, обеспечении клеточной адгезии в процессе морфогенеза. Основным компонентом ЭКМ является вода, содержащая комплекс различных гликопротеинов, глюкозаминогликанов, протеогликанов, а в случае костной ткани — кристаллы минералов. Наиболее распространенным гликопротеином ЭКМ является коллаген. В состав ЭКМ также входят фибринонектин (интегрин), ламинин, необходимый для развития нервной клетки, тена-скин, обеспечивающий антиадгезивное действие, эластин, необходимый для связи с гликопротеиновыми микрофибриллами, и т. д.

Плазматическая мембрана, или клеточная мембрана, — клеточная структура, выполняющая важную роль в реализации таких клеточных процессов, как эвдоцитоз, экзоцитоз, клеточная адгезия, клеточное движение, межклеточные взаимодействия и передача сигнала. Плазматическая мембрана является полупроницаемым барьером, состоящим из протеинов и липидов, выполняющих активную роль в осуществлении мембранных процессов. Толщина ПМ составляет 7 — 10 нм.

Цитоплазма — высокоупорядоченная многофазная коллоидная система (гиалоплазма*) с находящимися в ней органеллами, обязательная часть клетки между ПМ и ядром. Для цитоплазмы характерно постоянное движение ее коллоидных частиц и других компонентов. Она пронизана микротрубочками, филаментами и микрофиламентами, полимеризация или распад которых обеспечивает обратимые переходы участков цитоплазмы из золя в гель. Совокупность филаментов и микротрубочек составляет цитоскелет, с которым связаны изменения формы клетки и движение внутриклеточных структур.

Цитоскелет — клеточная структура цитоплазмы эукариотов, включающая микрофиламенты (5 — 7 нм), микротрубочки (24 нм) и ин-термедиатные филаменты (10 нм). Это динамическая сеть, участвующая в обеспечении ряда клеточных процессов (движение клетки, поддержание формы и геометрии, внутриклеточный транспорт цитоплазмы, движение клеточных ресничек и жгутиков).

Гиалоплазма — основная плазма, матрикс цитоплазмы; сложная, бесцветная коллоидная система, способная к переходам из состояния золя в гель.

Комплекс Гольджи, называемый также аппаратом Гольджи или пластинчатым комплексом, — совокупность органелл клетки, участвующих в ряде клеточных процессов (синтез гликопротеинов, секреция, синтез и утилизация компонентов мембран и др.). Структура комплекса Гольджи консервативна для всех эукариотов и включает в себя поляризованные органеллы и цистерны, поверхности которых не идентичны мембране. Он присутствует во всех клетках эукариотических

организмов (кроме эритроцитов млекопитающих). Его структурно-функциональная единица — диктосома.

Митохондрия — органелла клетки овальной формы. Число митохондрий зависит от типа клетки и максимально в активных клетках (кардиомиоцитах). Состоит из наружной и внутренней мембраны, межмембранного пространства, матрикса, содержащего ДНК. Основная функция митохондрий заключается в синтезе АТФ при окислении Сахаров и липидов. Они содержат ферменты цикла Кребса, а также цикла окисления жирных кислот и аминокислот.

Ядро — важная клеточная структура, содержащая ядрышки и хромосомы. Окружена ядерной оболочкой, которая состоит из двух отдельных мембран — внутренней и наружной, в некоторых местах мембраны соединены друг с другом; двухмембранная ядерная оболочка пронизана порами, на краях которых наружная мембрана переходит во внутреннюю. Через поры осуществляется обмен между ядром и цитоплазмой. Ядро содержит гранулы с ДНК и РНК и присутствует во всех эукариотических клетках.

Хлоропласт — внутриклеточная органелла растений, в которой осуществляется фотосинтез. Его длина 5 — 10 мкм, ширина 2 — 4 мкм.

Лизосома — субмикроскопическая частица (0,2 — 0,8 мкм) в цитоплазме, содержащая гидролитические ферменты. Образуется в КГ, осуществляет внутриклеточное пищеварение.

Рибосома — органелла клетки, осуществляющая биосинтез белка. Частица (диаметром около 2 нм) сложной формы. Состоит из двух — большой и малой — субъединиц, на которые может диссоциировать.

Эндоплазматический ретикулум — система мелких вакуолей и канальцев, соединешшге друг с другом, ограниченная мембраной. Толщина мембраны ЭР — 5 — 7 нм. Его производные — микротельца, а в растительной клетке — вакуоли.

Пероксисомы — небольшие вакуоли (0,3 — 1,5 мкм), связанные с мембранами ЭР. Играют важную роль в превращении жиров в углеводы. Участвуют в расщеплении перекиси водорода.

 

22------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Молекулярная организация клеточного ядра и функции. Ядерная оболочка. Ядерно-поровый комплекс. Транспорт молекул через ядерную мембрану.

 

Ядро (лат. nucleus) — это один из структурных компонентов эукариотической клетки, содержащий генетическую информацию (молекулы ДНК), осуществляющий основные функции: хранение, передача и реализация наследственной информации с обеспечением синтеза белка. Ядро состоит из хромати́на, я́дрышка, кариопла́змы (или нуклеоплазмы) и ядерной оболочки. В клеточном ядре происходит репликация (или редуплика́ция) — удвоение молекул ДНК, а также транскрипция — синтез молекул РНК на молекуле ДНК. Синтезированные в ядре молекулы РНК модифицируются, после чего выходят в цитоплазму. Образование обеих субъединиц рибосом происходит в специальных образованиях клеточного ядра — ядрышках. Таким образом, ядро клетки является не только вместилищем генетической информации, но и местом, где этот материал функционирует и воспроизводится.