Эндофитные микроорганизмы – продуценты биологически активных веществ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ  И НАУКИ 
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ АЛЬ-ФАРАБИ

 

Факультет биологии и биотехнологии

 

Кафедра биотехнологии

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

 

ЭНДОФИТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ – ПРОДУЦЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

 

 

Исполнитель: студент 4 курса	_________________	Успенская А.Д.
Научный руководитель: к.б.н., доцент	_________________	Игнатова Л. В.
Нормоконтролер:	_________________	Бектилеуова Н. К.
Зав. кафедрой, д.б.н., профессор	_________________	Заядан Б. К.

 

 

Алматы, 2013

 

 

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………........	3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………….............	5
1.1 История открытия и изучения эндофитных микроорганизмов………………………………………...............	5
1.2 Современные представления о системе «Эндофит-растение»………………………………………………………..	6
1.3 Экология эндофитных микроорганизмов…………………..	8
1.4 Эндофиты и устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды…………………………………………………	10
1.5 Современные технологии применения эндофитных микроорганизмов……………………………………………….	14
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………	23
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………….	24

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Эндофиты - ассоциативные микросимбионты, способные колонизировать внутренние ткани различных органов растений. Эти микросимбионты оказывают более выраженное позитивное влияние на рост растения-хозяина за счет компартментации внутри тканей растений. В последнее десятилетие для всех известных растительных симбиозов открыты новые многочисленные сопутствующие микроорганизмы, ведутся активные исследования в целях выявления и понимания роли таких ассоциативных микроорганизмов симбионтов в функционировании симбиоза в целом.

Опираясь на имеющиеся результаты исследований, современная литература рассматривает растения как центры формирования специализированных сообществ микроорганизмов [1]. В процессе роста они непрерывно выделяют в окружающую среду различные комбинации органических соединений [2], которые создают специфический статус филло- и ризосфреры каждого конкретного растения и создают селективные условия для взаимодействия с окружающими микроорганизмами, занимающими ту же экологическую нишу, определяют их таксономический состав и пространственно-функциональную организацию [3]. Подобные ассоциации разных видов организмов называют симбиоценозами микросимбионтов. В их составе, как правило, наблюдается пространственное разделение ассоциативных и доминантного симбионтов в специализированных экологических нишах растения-хозяина (полостях, межклетниках, клетках), в которых отсутствуют конкурентные отношения между ними.

Несмотря на то, что скрининговые исследования эндофитных микроорганизмов еще продолжаются, сейчас наибольший интерес представляют органические соединения или метаболиты, выделяемые эндофитами в окружающую среду, а так же их влияние на организм и жизненные функции растения-хозяина. Уже отмечено положительное влияние на вегетативный рост, на устойчивость ко многим неблагоприятным факторам, таким как засуха, фитопатогены, вредители, у растений, зараженных эндофитными микроорганизмами. Эти данные открывают большие перспективы использования эндофитов в сельском и лесном хозяйствах. Например, в сельском хозяйстве уже стартовало применение новый подход к созданию исходного материала для селекции и новых сортов кормовых злаковых трав. Он заключается в использовании преимуществ, возникающих при естественной симбиотической ассоциации злаковых трав с грибами-эндофитами. Симбиотическая селекция направлена на использование потенциала микробно-растительных взаимодействий, в том числе на поиск оптимальных сочетаний генотипов симбионта и растения хозяина [4].

Доказано, что в реальных экологических условиях, когда растения испытывают дефицит основных элементов питания и подвергаются действию различных стрессов, их выживание в большой степени зависит от образования симбиозов с микроорганизмами [5]. Так грибы-эндофиты увеличивают фенотипическое разнообразие своих растительных хозяев, повышая возможность их адаптации к условиям окружающей среды [6;7]. Аналогичную роль выполняют эндофитные бактерии. В их функции входит синтез фитогормонов, биоконтроль фитопатогенов, иммобилизация фосфатов, азотфиксация и др.

Однако, в отечественной  литературе исследования этой группы микроорганизмов пока немногочисленны.  Учитывая, что выявление и анализ веществ, продуцируемых эндофитными  микроорганизмами, позволяет расширить горизонты отечественной селекции кормовых растений и повысить устойчивость уже выведенных сортов, и эндофитные микроорганизмы могут составить альтернативу трансгенным растениям, становится очевидно, что их роль пока недооценена.

 

 

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История открытия и изучения эндофитных микроорганизмов

Активное изучение эндофитов началось со времени выхода статьи К.В.Бэкона с соавторами, посвященной отравлениям коров [8]. Актуальность исследования возникла в связи с массовыми отравлениями скота, выпас которого производился на пастбищах, засеяных тросниковой овсяницей (Festuca arundinaceae). Ежегодные потери животноводческого хозяйства США составили сотни миллионов долларов. Было выдвинуто предположение, что причиной массовых отравлений было попадание в корм склероциев Claviceps sp., так как симптомы отравления имели сходный характер.  Однако эта гипотеза не получила подтверждения. Растения внешне выглядели здоровыми, но на срезах был обнаружен мицелий, распространяющийся по межклетному пространству. На тех пастбищах, где у скота наблюдались симптомы отравления,  мицелий присутствовал у 100% растений. Исследователям удалось получить чистую культуру гриба, определенного как несовершенную стадию Epichloe typhina. Это событие ознаменовало новую эру  повсеместного изучения различных аспектов биологии этих грибов и их влияния на растения.  По мере накопления новых данных, увеличивалось количество описанных видов эндофитных грибов. Например, в многолетнем райграсе (L. perenne) встречается эндофит A. lolii. Из ковыля  (Spipa eminens) был получен изолят гриба, названного A.chisosum [9].  На основании вновь полученных данных, грибы из секции Albolanosa выделили в отдельный род Neotyhodium [6].    Большая часть видов Neotyhodium не имеют телиоморфы, показано их тесное родство с аскомицетами, принадлежащими к родам Epichloe и Balansia [10].

Carroll & Carroll в 1978 впервые предположили, что грибковые эндофиты, выделенные из игл хвойных, могут представлять собой мутуалистические симбионты. Это позволяет предполагать уменьшение вкусовой привлекательности для пасущихся насекомых и антагонизм против патогенов игл как возможные преимущества для деревьев-хозяев. В последующей работе эта группа изучала связь между Дугласовой пихтой (Pseudotsuga menziesii ) и эндофитом игл Rhabdocline parkeri [11].

В 1982—1983 годах при изучении райграсса пастбищного (Lolium perenne L.) было установлено, что устойчивость ряда сортов райграсса пастбищного к вредящим сельскому хозяйству фитофагам Listonotus (Hyperodes) bonariensis Kuschel обусловлена присутствием в организме растения, сожительствующего с ним гриба, так называемого Lolium-эндофита. Вскоре результаты исследований показали, что ассоциация райграсса пастбищного с тем же или сходным грибом-эндофитом придает злаку устойчивость еще к одному вредящему фитофагу — луговому мотыльку Grambus spp.. В растениях овсяницы Festuca arundinaceae Schreb, содержащих сходный или идентичный гриб-эндофит Epichloe typhina (Fr.) Tul. (позже переименованный в Acremonium coenophialum), были обнаружены характерные вторичные метаболиты — пирролизидиновые алкалоиды, N-ацетиллолин и N-формиллолин. В инфицированных эндофитом растениях райграсса пастбищного найдены нейротоксины , после чего было выдвинуто предположение, что именно все эти химические вещества придают злаку-хозяину эндофита устойчивость к фитофагам. Возможность того, что токсины эндофитных грибов, поражающих пастбищный райграсе (Lolium perenne), способны нести функцию защиты растения-хозяина от фитофагов, была подтверждена при изучении эндофита Acremonium. Этот эндофит вырабатывает вещества, токсичные для насекомых, и растения, резистентные к эндофитам, чаще погибают под влиянием насекомых-фитофагов. В результате экспериментов было доказано, что инфицирование райграсса эндофитными грибами приводит к появлению в райграссе нейротоксинов лолитрема А и В и еще двух нейротропных токсинов в семенах райграсса [11].

    В 1984 году Latch с соавторами изучали другие группы эндофитных грибов злаков. Среди их открытий  - роды Gliocladium и Phialophora найденные в многолетнем райграсе, в овсянице луговой, овсянице гигантской, в аризонской овсянице[12].

В 1984-1994 годах проведены выделения эндофитов, присутствующих на иглах различных видов хвойных. Согласно исследованиям Droby S, проведенных в разных странах, иглы всех проверенных зрелых хвойных были колонизированы несколькими видами эндофитов [13].

В 1998 году Naffaa и др. выделили другую группу эндофитных грибов, относящиеся к секции Symplex  рода Acremonium. Эти виды имеют более выраженные паразитические свойства и близки к A.chilense [14].

 

 

1.2 Современные представления о системе «Эндофит-растение»

Эндофитные микроорганизмы злаков стали классическим  примером  мутуалистических  отношений грибов и растений и служат им уже более тридцати лет. Среди грибов это представители рода Neotyphodium и родственные им  представители трибы Balansiae (сем. Clavicipitaceae, пор. Hypocreales,  п/ отд.  pezizomycotina,  отд. Ascomycota). Среди бактерий – род Bacillus, Herbaspirillum. Эндофитные дрожжи пока малоизученны. Эндофитные грибы живут бессимптомно в надземных органах многих злаков. Растение получает защиту от выедания и от различных абиотических стрессов благодаря различным метаболитам микромицета. Гриб распространяется только вертикально вместе с семенами растения-хозяина. Однако на настоящий момент опубликовано уже значительное количество работ, в которых или не выявлено  вообще никакого эффекта эндофитных грибов на рост и развитие растений, или даже получены результаты об отрицательном их влиянии [15]. В связи с этим в последнее время разрабатывается теория о сбалансированном паразитизме эндофитных грибов. В экологии также предлагается альтернативная точка зрения на отношения эндофитных грибов и растения-хозяина. Для эндофитного гриба экологическая ниша практически полностью сводится к растению-хозяину: в нем он живет, им питается, через него  доходят все факторы внешней среды  – такие как свет,  температура, активность воды и т.д. Растение, заселенное эндофитным грибом (Е+), будет меняться. Как бы  ни развивались отношения хозяина и симбионта, грибной мицелий будет выделять те или иные метаболиты которых бы в незараженном растении (Е-) не было. Меняется  внутренняя  среда растения, его клетки начинают реагировать на новые биохимические сигналы. В зависимости от генотипов растения и гриба, их возраста и условий внешней среды эти изменения могут быть выражены сильнее или слабее, но в любом случае можно утверждать, что при наличии развитого внутритканевого  мицелия  физиолого-биохимические  процессы растения изменятся и это будет уже другой организм [16].

Будет ли растение, заселенное эндофитным грибом выгодно отличаться от своих сородичей   – это вопрос каждого конкретного случая. В различных экспериментах получены данные как о положительном влиянии эндофита,  так и об  отсутствии какого-либо влияния вообще [15]. В условиях, когда растение сильно угнетено и ослаблено, эндофит может проявлять сильное отрицательное влияние,  и начать паразитировать на своем хозяине. С другой стороны, гриб может перейти в скрытое, латентное состояние, и тогда Е+ растение ни по своим реакциям, ни при микроскопическом анализе не будет отличаться от не заселенных эндофитным грибом растений  – вплоть до тех пор, когда изменившиеся условия активизируют рост мицелия в растении.

Изучение  распределения  мицелия  в  отдельных растениях  полностью  согласуется  с  этой  теорией. В последних исследованиях получены следующие результаты: заселенные эндофитным грибом растения могут образовывать  незараженные вегетативные побеги, вплоть до полного отсутствия мицелия в надземной части растения в определенное время года. Дефицит воды стимулирует развитие мицелия в тканях растения. При образовании генеративных побегов, некоторые побеги тоже могут быть свободными от мицелия, а на зараженных побегах могут образовываться незараженные семена. При изучении цветков и семян овсяницы луговой мицелий обнаруживается не только в алейроновом слое семени, как считалось ранее, но и в самом зародыше, что для этой группы грибов считалось нехарактерным. Таким образом,  ассоциация  «эндофит-растение»  представляет собой сложную динамическую систему, которая очень лабильна и способна быстро реагировать на изменяющиеся условия среды [17].

 

 

1.3 Экология эндофитных микромицетов и дрожжей

Традиционно считается, что  мицелий эндофитных грибов локализован исключительно в надземных органах растений, так как при микроскопии срезов корней растений присутствие грибных гиф не отмечается. Однако, при исследовании молодых проростков, выращенные на питательной среде из зараженных семян (поверхностно стерилизованных), выделение гриба на питательную среду происходит не только из самого семени и в месте контакта листьев проростка с питательной средой, но и из корня. Корни при этом имеют небольшие утолщения. Срезы утолщенной части корня несут обильное сплетение гиф, которое располагается под эпидермисом, но не заходит в центральный цилиндр [5].

Эндомикоризные грибы широко распространены в различных почвенно-географических зонах страны. Характерной  особенностью  арбускулярно–микоризных грибов является широкий круг растений–хозяев. Они образуют микоризу со злаковыми, бобовыми, цитрусовыми, сложноцветными, хвойными и др. Действие арбускулярно-микоризных грибов проявляется в повышении активности роста и урожайности сельскохозяйственных растений. При этом элементы минерального питания поглощаются из  почвы наружными гифами  эндофита  и поступают во  внутренние  грибные структуры, а затем попадают в растение. Известно, что гифы арбускулярно-микоризных грибов способны трансформировать труднодоступные элементы минерального питания из почвенного слоя   – 7–15 см [18]. Степень микоризации корней зависит от вида растения, типа почвы, ее оструктуренности, механического состава, рН среды, способа обработки, наличия предшественников и других факторов. Степень микоризации корней зависит от вида растения-хозяина и эндомикоризного гриба. При соответствующем подборе партнеров можно получить эффективный симбиоз для конкретных  почвенно-климатических условий  [18].