Ферменты, используемые в генной инженерии их основные свойства и применение

Министерство  образования и науки РФ

Волгоградский Государственный Технический Университет

Кафедра «промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Семестровая работа

По  курсу «Основы молекулярной биотехнологии»

На  тему: «Ферменты, используемые в генной инженерии их основные свойства и применение»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила: cтудентка группы ЭКОМ-6                            Сидорова И. Г.

 

 

Проверил:

Нефедьева Е.Э.

 

 

 

 

 

Волгоград 2012

Содержание

 

Введение 2

1 Полимеразы 4

1.1 Общее представление о полимеразах 4

1.2 ДНК – полимераза 4

1.3 РНК – полимераза 9

2 Ферменты, модифицирующие ДНК 11

3 Лигазы 13

4 Фосфотаза 14

5 Киназы 16

Заключение 21

Список использованных  источников 22

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам  генетической энзимологии и химии  нуклеиновых кислот, так как инструментами  молекулярного манипулирования  являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами можно работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Этими инструментами могут выступать ферменты.

Только они могут найти  определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "зашить" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому  экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК  любого происхождения в избранной  им последовательности. Это позволяет  генной инженерии преодолевать установленные  природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание. Таким образом, ферменты генетической инженерии - это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии .

1 Полимеразы

1.1 Общее представление  о полимеразах

Полимеразы –  ферменты, катализирующие образование макромолекул из низкомолекулярных веществ. Важнейшие из полимераз – нуклеотидилтрансферазы, катализирующие синтез нуклеиновых кислот из нуклеозидтрифосфатов при использовании в качестве матрицы ДНК или РНК. Под действием полимераз нуклеозидтри – фосфаты переносятся к концу синтезируемой цепи нуклеиновой кислоты и происходит удлинение цепи на одну нуклеотидную единицу, сопровождающееся высвобождением молекулы пирофосфата. К полимеразам относятся ДНК-зависимая РНК-полимераза, осуществляющая транскрипцию ДНК, ДНК-зависимая ДНК-полимераза, катализирующая репликацию ДНК, РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, обнаруженная в онкогенных и неонкогенных вирусах) и РНК-зависимая РНК-полимераза (РНК-репликаза, осуществляющая синтез РНК в клетках, инфицированных РНК-содержащими вирусами).

1.2 ДНК – полимераза

ДНК-полимераза — фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибо-нуклеотидоввдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна шаблонной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали.

Выделяют ДНК – зависимую ДНК-полимеразу использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (другое название обратная транскриптаза), способную также к считыванию информации с РНК (обратная транскрипция).

ДНК-полимеразу считают холоферментом, поскольку для нормального функционирования она требует присутствия ионов магния в качестве кофактора. В отсутствие ионов магния о ней можно говорить как об апоферментe. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Среднее количество нуклеотидов, присоединяемое ферментов ДНК-полимеразой за один акт связывания/диссоциации с матрицей, называют процессивностью.

Как известно, две цепи молекулы ДНК антипараллельны. Разные концы  одной цепи называются 3’-конец и 5’-конец. Репликация происходит путем  непрерывного роста нуклеотида за нуклеотидом  обеих новых цепей одновременно. Матрица считывается ДНК-полимеразой  только в направлении 3’-5’, добавляя свободные нуклеотиды к 3’-концу  собираемой цепочки. Поэтому синтез ДНК происходит непрерывно только на одной из матричных цепей, называемой «лидирующей». Во второй цепи («отстающей») синтез происходит короткими фрагментами.

Ни одна из известных ДНК-полимераз  не может создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять  нуклеотиды к уже существующей 3’-гидроксильной  группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере, к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят из оснований РНК и ДНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом — праймазой. Ещё один фермент — геликаза — необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад. Благодаря своей 3'-5' экзонуклеазной гидролитической активности ДНК-полимераза может исключить неправильный нуклеотид из цепочки и затем вставить на его место правильный, после чего репликация продолжается в нормальном режиме. Структура ДНК-полимераз достаточно жёстко фиксирована. Их каталитические субъединицы очень мало различаются в различных видах живых клеток. Такая фиксация структуры обычно появляется там, где отсутствие разнообразия обусловлено огромной важностью или даже незаменимостью для функционирования клетки.

Генами некоторых вирусов тоже кодируются особые ДНК-полимеразы, которые могут избирательно реплицировать вирусные ДНК. Ретровирусы обладают геном необычной ДНК-полимеразы, называемой ещё обратной транскриптазой, являющейся РНК-зависимой ДНК-полимеразой и осуществляющей сборку ДНК на основе шаблонной РНК.

У бактерий обнаружено пять ДНК-полимераз:

- ДНК-полимераза I задействована в восстановлении ДНК, обладает и 5'-3', и 3'-5'-экзонуклеазным действием;

- ДНК-полимераза II участвует в репликации поврежденной ДНК. Обладает способностью 5'-3'-удлинения цепочки и 3'-5'-экзонуклеазным действием;

- ДНК-полимераза III — основная полимераза бактерий, обладающая также 3'-5'-экзонуклеазным действием;

- ДНК-полимераза IV, ДНК-полимераза семейства Y;

- ДНК-полимераза V, ДНК-полимераза семейства Y, принимающая участие в пропуске поврежденных участков ДНК.

Эукариоты содержат по меньшей мере пятнадцать видов ДНК-полимераз:

- ДНК-полимераза α выступает сначала в роли праймазы, синтезируя праймер ДНК, а затем как нормальная полимераза, присоединяя к этому праймеру нуклеотиды. После того, как длина цепочки достигнет около 20 нуклеотидов, к транскрипции приступают полимеразы δ и ε;

- ДНК-полимераза β задействована в восстановлении ДНК;

- Pol γ, осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК;

- ДНК-полимераза δ — основная полимераза эукариот. Она высокопроизводительна, а также обладает 3'-5'-экзонуклеазным действием;

- ДНК-полимераза ε, иногда замещающая ДНК-полимеразу δ во время синтеза 3’-5’-моноспирали. Основное назначение этой полимеразы неясно;

- ДНК-полимеразы η, ι, κ, и Rev1 из семейства Y, а также ζ из семейства B. Эти полимеразы задействованы в пропуске поврежденных участков ДНК.

Существуют также другие эукариотические ДНК-полимеразы, которые пока недостаточно изучены: θ, λ, φ, σ и μ. Обнаружены и другие эукариотические полимеразы. Ни одна эукариотическая полимераза не может отщеплять праймеры, то есть не обладает 5’-3’-экзонуклеазным действием. Эту функцию выполняют другие ферменты. Только полимеразы, осуществляющие элонгацию (γ, δ и ε) обладают 3'-5'-экзонуклеазными свойствами.

Что касается изучения свойств ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, её проводили при добавлении к вирионам с ранее разрушенной РНК экзогенных нуклеиновых кислот. Добавление на-тивной ДНК Е. coli и тимуса приводило к возрастанию включения Н3-тимидина в 10—15 раз по сравнению с контролем; включение снижалось в 2—4 раза при использовании тех же ДНК в денатурированном состоянии (S. Mizu-tani et el., 1970). Интересные данные получены при изучении полимеразной реакции на матрице синтетических нуклеиновых кислот (S. Spiegelman et al., 1970; S. Mizutani et al., 1970). Однонитчатые гомополимеры полирибоаденин (pA), полидезок-ситимидин (рТ), полидезоксиаденин (рА) практически не индуцировали реакцию полимеризации; лучшими матричными свойствами обладали полирибоцитидин и полидезокси-цитидин (рЦ и дЦ). Использование синтетических двуспи-ральных нуклеиновых кислот позволило выяснить некоторые закономерности протекания реакции превращения РНК : ДНК гибрида в двуспиральную ДНК - Было обнаружено, что некоторые синтетические двуспиральные структуры во много раз превосходят естественные ДНК (например, ДНК ткани цыплят) по активности в полимеразной реакции. Наибольшей активностью обладал гибрид дЦ : рГ, особенно с полимеразой из вирусов миелобластоза птиц и лейкемии Раушера. Активность двунитчатых синтетических РНК и ДНК была несколько меньшей, чем гибридов.

Обратная транскриптаза (также известная как ревертаза или РНК зависимая ДНК-полимераза) –фермент катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Называется так потому, что большинство процессов транскрипции в живых организмах происходит в другом направлении, а именно, с молекулы ДНК синтезируется РНК-транскрипт.

Обратная транскриптаза  была открыта Говардом Теминым в Университете Висконсин-Мэдисон и независимо Дэвидом Балтимором в 1970 году в Массачусетском технологическом институте. Оба исследователя получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины в 1975 году совместно с Ренато Дульбекко. Обратная транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную ей ДНК, а затем на этой цепи ДНК, как на матрице, достраивает вторую цепь. Ретротранспозоны эукариот кодируют обратную транскриптазу, которая используется ими для встраивания в геном хозяина подобно тому, как это происходит у вирусов. Обратной транскриптазой является также теломераза. В генетической инженерии обратную транскриптазу используют для получения кДНК — копии эукариотического гена, не содержащей интронов. Для этого из организма выделяют зрелуюмРНК, кодирующую соответствующий генный продукт (белок, РНК) и проводят с ней в качестве матрицы обратную транскрипцию. Полученную кДНК можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта.

1.3 РНК – полимераза

РНК-полимераза — фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. В узком смысле, РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию. Ферменты класса РНК-полимераз очень важны для функционирования клетки, поэтому они имеются во всех организмах и во многихвирусах. Химически РНК-полимеразы являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на 3'-конце цепи РНК.

РНК-полимераза была открыта  независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем в 1960. К этому моменту Нобелевская премия по медицине в 1959 году уже была присуждена Северо Охоа и Артуру Корнбергу за открытие вещества, которое считали РНК-полимеразой, впоследствии оказавшегося рибонуклеазой.

Нобелевская премия по химии  в 2006 году была присуждена Роджеру Корнбергу за получение точных изображений молекул РНК-полимеразы в различные моменты процесса транскрипции. РНК-полимераза была открыта независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем в 1960. К этому моменту Нобелевская премия по медицине в 1959 году уже была присуждена Северо Охоа и Артуру Корнбергу за открытие вещества, которое считали РНК-полимеразой, впоследствии оказавшегося рибонуклеазой.

Управление процессом  транскрипции генов позволяет контролировать экспрессию генов и таким образом позволяет клетке адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, поддерживать метаболические процессы на должном уровне, а также выполнять специфические функции, необходимые для существования организма. Неудивительно, что действие РНК-полимеразы очень сложно и зависит от множества факторов (так, уEscherichia coli идентифицировано более 100 факторов, тем или иным способом влияющих на РНК-полимеразу). РНК-полимераза начинает транскрипцию с особых участков ДНК, называемых промоторами и производит цепочку мРНК, комплементарную соответствующей части нити ДНК. Процесс наращивания молекулы РНК нуклеотидами называется элонгацией. В эукариотических клетках РНК-полимераза может собирать цепочки из более 2,4 млн элементов (например, такую длину имеет полный ген белка дистрофина).

РНК-полимераза завершает  формирование цепочки РНК, когда  встречает в ДНК специфическую последовательность, называемую терминатором.

РНК-полимераза производит следующие  разновидности РНК:

- матричная РНК (мРНК) — шаблон для синтеза белков в рибосомах;

- некодирующая РНК или «РНК-ген» — большой класс генов, кодирующих РНК, на которых не может быть построено белка. Самые известные представители этого класса — транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК), сами участвующие в процессе синтеза белка. Однако начиная с поздних 90-х годов XX столетия было обнаружено много других РНК-генов. Это дало возможность предположить, что РНК-гены играют более значительную роль в клетке, чем было принято считать раньше;