Цитогенетичекий метод

Каждый организм характеризуется  определенным набором хромосом, который  называется кариотипом. Кариотип человека состоит из 46 хромосом – 22 пары аутосом и две половые хромосомы. У женщины это две X хромосомы (кариотип: 46, ХХ), а у мужчин одна Х хромосома, а другая – Y (кариотип: 46, ХY). В каждой хромосоме находятся гены, ответственные за наследственность. Исследование кариотипа проводится с помощью цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов.

Кариотипирование – цитогенетический метод - позволяющий выявить отклонения в структуре и числе хромосом, которые могут стать причиной бесплодия, другой наследственной болезни и рождения больного ребенка.

В медицинской генетике имеют  значение два основных типа кариотипирования:

1. изучение кариотипа пациентов
2. пренатальное кариотипирование - исследование хромосом плода.

В 1956г. было доказано, что  в соматических клетках человека содержится 46 хромосом (в половых 23 хромосомы) - носителей генетической информации. В конце 60-х – начале 70-х годов были разработаны методы, позволяющие различить каждую хромосому  и исследовать ее структуру. Благодаря  этому было установлено, что множество  тяжелых врожденных заболеваний  определяется нарушениями структуры  хромосом или их количества в клетке.

Ряд нарушений структуры  или количества хромосом не проявляется  никакими симптомами. Единственной причиной для обращения к врачу у  таких пациентов может быть бесплодие. Поэтому клиника репродукции  является нередко единственным учреждением, где такое нарушение может  быть выявлено и приняты меры для  его преодоления.

Кариотипирование при бесплодии показано в следующих случаях:

1. Необструктивная азооспермия
2. Тяжелая олигозооспермия (<5 млн/мл).
3. Задержка полового развития
4. Первичная аменорея
5. Вторичная аменорея (преждевременная менопауза)

Привичное невынашивание раннего срока беременности (наличие 2 и более самопроизвольных абортов в первом триместре беременности) - обследуются оба родителя. В семьях с отягощенным акушерским анамнезом (привычное невынашивание, особенно ранних сроков, мертворождение, рождение ребенка с множественными врожденными пороками развития (МВПР) - хромосомные нарушения встречаются от 5 до 15% случаев

Обследование доноров  спермы и яйцеклеток.

В некоторых случаях цитогенетического  исследования бывает недостаточно для  выдачи заключения о кариотипе, в  этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Метод – FISH позволяет выявлять более тонкое строение отдельных районов определенных хромосом, быстро исследовать какой либо хромосомный участок в различных тканях (органах). Он актуален в тех случаях, когда исследуемый материал имеется в малом количестве.

Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и  число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников  или плода при подозрении на хромосомный  синдром либо другое хромосомное  нарушение.

Объектом исследования служат культуры лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, клеток других тканей.

С помощью метода определяется наличие Х и У полового хроматина, определяющего истинную половую принадлежность. Половой хроматин (тельце Барра) - в виде компактной глыбки в ядрах соматических клеток имеется только у женщин. Он определяется в эпителиальных клетках ротовой полости, вагинальном эпителии и клетках волосяной луковицы.

Показания для цитогенетического  обследования больного:

1. множественные пороки развития (с вовлечением трех и более систем); наиболее постоянные нарушения - пороки развития головного мозга, опорно-двигательной системы, сердца и мочеполовой системы;
2. умственная отсталость в сочетании с нарушениями физического развития, дисплазиями, гипогенитализмом;
3. стойкое первичное бесплодие у мужчин и у женщин при исключении гинекологической и урологической патологии;
4. привычное невынашивание беременности, особенно на ранних стадиях;
5. нарушение полового развития (гипогонадизм, половые инверсии);
6. небольшая масса ребенка, рожденного при доношенной беременности.

Применение цитогенетического  метода в клинической генетике обусловило развитие нового направления - клинической  цитогенетики, которая позволяет:

1. установить происхождение структурно перестроенных хромосом и их точную классификацию;
2. выделить синдромы, обусловленные дисбалансом по участкам индивидуальных хромосом;
3. накапливать сведения об изменениях хромосом в опухолевых клетках, у больных с наследственными заболеваниями крови и т.д.

Главный недостаток методов, основанных на использовании низших организмов, заключается в невозможности  экстраполировать полученные результаты на человека в связи с отсутствием  процессов метаболической активации  и детоксикации, характерных для всех млекопитающих, включая человека. На практике этот недостаток частично восполняется применением экзогенной системы метаболической активации in vitro. Однако метаболическая активация in vitro может характеризовать только начальные этапы метаболизма и соответственно не дает полного представления о судьбе вещества в целом организме. Поэтому методы, выполняемые на млекопитающих in vitro, имеют несомненно положительные стороны и позволяют регистрировать конечные результаты действия вещества. Для изучения мутагенных эффектов генотоксичных агентов in vivo разработаны различные методы (один из них – метод щелочной элюции ДНК). Наиболее распространенными являются цитогенетические методы. Они включены в качестве одного из основных в общепринятые наборы тест-систем оценки мутагенности химических соединений.

Существует высокая корреляция (более 90%) между способностью химического  агента вызывать разрывы хромосом и  генные мутации. Несмотря на то, что  механизмы этих двух явлений в  большинстве случаев различны, цитогенетическая активность вещества может указывать  и на его способность индуцировать генные мутации.

В цитогенетических тестах анализируется весь геном целиком  непосредственно в микроскоп, что  имеет большое значение в случае соединений, которые имеют специфические  участки действия (горячие точки). Еще одним преимуществом является то, что эти методы выполняются  сравнительно быстро и со сравнительно скромными затратами. Ниже описываются  часто используемые цитогенетические методы, выполняемые как in vitro, так и in vivo.

Учет хромосомных аберраций. Изменение числа и структуры  хромосом в соматических клетках  и зародышевых клетках могут  возникать спонтанно или после  воздействия физическими и химическими  агентами. Нарушения хромосом, возникающие  в зародышевых клетках, приводят к разнообразной врожденной патологии  у человека. Эти нарушения принято  относить к мутациям, которые могут  быть разделены на геномные в случае изменения числа хромосом и хромосомные  – при структурных нарушениях.

Многочисленные работы последних  лет свидетельствуют о том, что  накопление хромосомных мутаций  в соматических клетках является одним из факторов, индуцирующих развитие клонов злокачественных клеток, а  также процессы старения.

Анализ хромосом соматических клеток методически хорошо разработан. Аномалии хромосом в экспериментальных  условиях можно индуцировать различными агентами в клеточных культурах  и в соматических клетках лабораторных животных in vivo. В последнем случае обычно в качестве модели используют клетки костного мозга животных.

Все хромосомные аберрации, возникающие в соматических клетках  человека и животных, учитываемых  на стадии метафазы, разделяют на 2 основные группы: хромосомные и хроматидные. Отнесение той или иной аберрации к хромосомному или хроматидному типу зависит от того, на каком уровне (хромосомы или хроматиды) повреждена хромосома, включенная в перестройку.

Аберрации хромосомного типа отражают повреждение хромосомы  на предсинтетической стадии (G1-фаза), когда она представляет собой однонитевую структуру, тогда как аберрации хроматидного типа возникают при повреждении хромосомы на двунитчатой стадии, то есть в фазе S и G2. Нередко при повреждении обеих хроматид хромосомы в идентичных локусах возникают изохроматидные разрывы, морфологически неотличимые от аберраций хроматидного типа. Аберрации могут быть простыми и обменными. Нарушение целостности одной или нескольких хромосом с образованием свободных или связанных с ней фрагментов относят к простому типу аберраций, тогда как перестройка участков одной и той же хромосомы или перекомбинации участками между несколькими хромосомами – к обменному типу.

Обменные аберрации могут  быть внутрихромосомными и межхромосомными. В зависимости от локализации внутрихромосомные аберрации разделяют на внутриплечевые и межплечевые. При межхромосомных обменах, если ацентрические фрагменты соединяются с центрическими, то обмены классифицируют как симметричные, а в случае соединения центрических фрагментов – как асимметричные. В последнем случае обмен характеризуется появлением полицентрических хромосом и хроматид. Внутрихромосомные и межхромосомные обмены могут быть полными и неполными. При полных обменах происходит воссоединение всех перекомбинирующихся участков поврежденных хромосом[3].

Культура лейкоцитов человека широко используется для изучения радиационного  и химического мутагенеза у человека. Изменения лейкоцитов периферической крови человека в процессе культивирования в присутствии ФГА достаточно исследованы.

При таком культивировании  происходит гибель всех форм лейкоцитов за исключением малых лимфоцитов, которые претерпевают изменения, приводящие к митозу. Поэтому при анализе  митотических клеток, по существу, имеем  дело с культурой лимфоцитов.

К достоинствам культуры лимфоцитов человека относятся доступность  материала, синхронность клеточной  популяции, низкий уровень спонтанного  мутирования, отработанность техники культивирования и изученность морфологии хромосом.

Для целей тестирования используют микро- или полумикрометод культуры лимфоцитов. Анализ хромосом проводят на метафазных пластинках с хорошо окрашенными и разбросанными хромосомами. При этом метафазные пластинки не должны иметь большое количество наложений хромосом и уровень конденсации их должен быть таким, чтобы акроцентрические хромосомы были видны в виде четко выраженных структур. Но анализируются метафазные пластинки с хромосомами, вошедшими в анафазу, так как трудно дифференцировать их от парных фрагментов. Из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке. Поэтому при учете хромосомных аберраций обычно анализируется клетка с числом хромосом от 44 до 47.

При тестировании химических соединений на мутагенную активность хромосомные аберрации учитывают  без кариотипирования. Кариотипирование метафазной пластинки применяют в специальных исследованиях, например, при изучении распределения повреждений по группам хромосом, их длине.

Долгое время спорным  являлся учет пробелов (брешей) в  качестве аберраций. В настоящее  время принято пробелы регистрировать отдельно, не включая их в число  учитываемых аберраций. Частота  пробелов в значительной степени  зависит от качества окраски и  степени спирализации хромосом.

О мутагенной активности судят  по частоте хромосомных аберраций, превышающей спонтанный уровень  в норме. Типы индуцированных химическими  мутагенами аберраций, как правило, аналогичны типам спонтанных аберраций.

При тестировании химических соединений эксперименты проводят в  два этапа. Первый этап предполагает обнаружение возможного эффекта  вещества в максимальной концентрации, обработку культур проводят на 48 часу роста и фиксируют клетки на 72 часу. При наличии эффекта переходят к изучению зависимости доза-эффект (2-й этап).

Костный мозг млекопитающих  является наиболее широко используемой моделью для исследования мутагенной активности химических соединений in vivo. Это связано, во-первых, с тем, что клетки костного мозга имеют высокую пролиферативную активность и, во-вторых, простотой приготовления препаратов. Морфология хромосом большинства видов лабораторных животных хорошо изучена.

Тестирование обычно проводят на мышах, анализируют и учитывают  как число метафаз с аберрациями, так и общее число структурных  нарушений хромосом.

Клетки костного мозга  асинхронны и для установления наиболее чувствительной стадии клеточного цикла  анализируют различные клеточные  популяции, зафиксированные в различные  сроки после воздействия. Рекомендуют  фиксировать клетки через 6, 24 и 48 часов  после введения животным тестируемого агента.

Уровень хромосомных аберраций  в клетках костного мозга достаточно низок и составляет у большинства  линий лабораторных мышей 1-2%.

Для работы обычно выбирают линии с низкой и стабильной частотой (=1%) спонтанных аберраций. Мыши CBA/L acY, F1(C3Hx101) и F1(CBAxC57 BL/6) имеют низкий уровень спонтанных аберраций. Однако они по чувствительности к действию ряда мутагенов существенно отличаются друг от друга.

Метод учета хромосомных  аберраций в клетках костного мозга млекопитающих является составной  частью практически всех комплексов методов оценки мутагенных свойств  у химических веществ, принятых почти  во всех странах мира проводящих такую  оценку.