Методы исследования структуры клетки

Расшифровка рентгенограмм, образованных крупными и неупорядоченными молекулами белков, до 1960 года была невозможна. В последние годы рентгеноструктурный анализ все более автоматизируется. Рассеянные рентгеновские лучи измеряются электронными детекторами, а компьютеры выполняют необходимые вычисления. В настоящее время наиболее длительным этапом в подобном исследовании является этап получения подходящих кристаллов исследуемых макромолекул; зачастую на подбор оптимальных условий кристаллизации уходят годы. Имея хорошие кристаллы, можно рассчитать структуру белка с разрешением 0,3 нм и выявить не только основные закономерности расположения полипептидной цепи, но и некоторые более мелкие детали. Именно таким образом к настоящему времени были установлены структуры более сотни белков и нескольких малых молекул РНК и ДНК.

  4. Фракционирование  клеток

  Для установления  функций отдельных компонентов  клетки важно выделить их в  чистом виде, чаще всего это  делается с помощью метода  дифференциального центрифугирования. Разработаны методики, позволяющие  получить чистые фракции любых  клеточных органелл. Получение фракций  начинается с разрушения плазмалеммы  и образования гомогенна клеток. Гомогенат последовательно центрифугируется при различных скоростях, на первом этапе можно получить четыре фракции: (1) ядер и крупных обломков клеток, (2) митохондрий, пластид, лизосом и пероксидом, (3) микросом — пузырьков аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, (4) рибосом, в супернатанте останутся белки и более мелкие молекулы. Дальнейшее дифференциальное центрифугирование каждой из смешанных фракций позволяет получить чистые препараты органелл, к которым можно применять разнообразные биохимические и микроскопические методы.

  Широкое применение  при изучении структуры клетки  получили и спектроскопические  методы – абсорбционная и флуоресцентная  спектроскопия, дисперсия оптического  вращения и круговой дихроизм, ядерный магнитный резонанс.

  Абсорбционная спектроскопия основана на измерении степени поглощения света молекулами, которая зависит от их структуры и окружения. С помощью этого метода можно проводить измерение концентрации растворенных веществ, исследование химических реакций, идентификацию веществ. Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра.

Для ряда молекул поглощение света сопровождается испусканием (флуоресценцией) света с большей длиной волны (то есть меньшей энергией). Спектры испускания также зависят от окружения молекул, поэтому регистрация и измерение таких спектров дает информацию о свойствах макромолекул и их взаимодействиях с другими молекулами. Прибор для измерения флуоресценции называют спектрофлуориметр и с помощью такого прибора изучают строение и структурные особенности белков и нуклеиновых кислот, определяют вязкость внутри живых клеток, проводят количественное определение ДНК и так далее.

  Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм – методы, основанные на изучении взаимодействия оптически активных молекул с поляризованным светом. С помощью этих методов можно изучать структуру и пространственные изменения в ферментах, нуклеиновых кислотах и других биомолекулах, содержащих оптически активные центры.

  Ядерный  магнитный резонанс (ЯМР) – еще один спектроскопический метод, способный давать информацию о структуре веществ, взаимодействиях между молекулами и о молекулярном движении, в частности в белках и нуклеиновых кислотах. Ампулу с образцом помещают в магнитное поле и регистрируют резонансную частоту перехода атомных ядер и ее смещение, обусловленное окружением. Полученный спектр сравнивают с рассчитанным и с данными других методов исследований, и делают соответствующие выводы. Интерпретация результатов ЯМР-спектроскопии, в особенности применительно к молекулам большого размера, очень трудоемкая и непростая задача, которая под силу только специалистам – профессионалам в этой области.

  Еще одним методом  изучения клетки или ее части  является авторадиография. Этот метод основан на поглощении радиоактивного изотопа клеткой и выявлении его внутриклеточной локализации. Полученные этим методом изображения изучают под микроскопом. Таким способом можно, например, подсчитывать число молекул ДНК, изучать влияние различных факторов на метаболизм клетки и так далее.

  Очень важно отметить, что изучение структурной и  химической организации клеток  можно проводить только на  специально подготовленных образцах. Для этого применяют целый  ряд методов. Перед тем, как кратко  охарактеризовать основные из  них, следует выделить два основных  пути исследования клеток.

• Первый – это наблюдение клеток в организме или в свежевыделенной из организма ткани;  
• второй – наблюдение клеток, убитых с помощью специальных методов, сохраняющих их морфологическую и химическую структуру. Такие специальные методы называют фиксацией.

  К методам исследования  живых клеток относятся культура  ткани и микрургия.

  Культура ткани позволяет  наблюдать клетку в наиболее  благоприятных условиях. Этот метод  заключается в том, что мелкие  кусочки тканей помещают в  среду, в которой клетки способны  к автономному росту и, поддерживая  температуру, свойственную организму, наблюдают их развитие и рост. Таким способом изучают пищевые  потребности клетки, влияние на  них различных экспериментальных  условий, а также получают чистые  клеточные линии.

  Микрургия заключается в том, что внутрь клетки вводят какой-либо микроинструмент (микропипетка, микроигла, микроэлектрод и другие), движения которого в поле зрения микроскопа регулируются специальным приспособлением. Таким методом можно рассекать клетки и извлекать некоторые их части, вводить в клетку различные вещества, измерять ее электрическую активность или пересаживать отдельные органеллы из одной клетки в другую.

 Фиксация представляет собой такой способ умерщвления клетки, который обеспечивает сохранение ее прижизненной структуры и в известной степени химического состава. Фиксацию проводят специальными реагентами (например, смесь абсолютного спирта и ледяной уксусной кислоты), путем быстрого замораживания и последующего обезвоживания в вакууме (лиофилизация) и другими методами. Подготовленные образцы окрашивают, делают необходимые срезы и исследуют с помощью указанных выше методов и приборов.

  Заключение

  В ходе выполнения  данной  работы были рассмотрены  разнообразные методы, которые используются  для изучения клеток на современном  этапе научного развития. Приведенные  в формате данной работы методы  можно систематизировать на основе  их подхода к исследованию. Можно  выделить методы статического  исследования, такие как: а) методы  оптической микроскопии; б) методы  электронной микроскопии; в) методы  фракционирования клеточного содержимого; г) рентгеноструктурный анализ.

    Набор функциональных  методов очень богат и не  полностью освещен в данной  работе, поскольку не возможно  описать все их разнообразие  в таком формате, например, не  учтено много разнообразных генетических  методов, которые помогают установить  функции многих молекул, а также  механизмы наследования.

  Из изложенного материала  следует, что современная клеточная  биология оперирует множеством  методов, позволяющих исследовать  клетку не только в ее статическом  проявлении, но и разобраться  в ее функционировании на молекулярном  уровне.

Список используемой литературы

1. Албертс, Б.А. Молекулярная биология клетки / Б.А. Албертс. - М.: Мир, 1987. – 268 с.
2. Дюв, К.Д. Путешествие в мир живой клетки / К.Д. Дюв. – М.: Мир, 1987. – 245 с.
3. Зенгбуш, П.А. Молекулярная и клеточная биология. В 3-х т. / П.А. Зенгбуш. - М.: Мир, 1982. – 204 с.
4. Ленинджер, А.В. Основы биохимии. В 3-х т. / А.В. Ленинджер. - М.: Мир, 1985. – 442 с.
5. Страйер, Л.В. Биохимия. В 3-х т. / Л.В. Страйер. - М.: Мир, 1985. – 303 с.
6. Третьяк, А. П. Молекулярная биология / А.П. Третьяк. - Чернигов.: 1999. – 380 с.